N-乙酰半胱氨酸对氟诱导雄性大鼠海马细胞凋亡及ATF-6蛋白表达的影响

刘晓蕙，刘文一，李 博，裴兰英，王瑾瑾，闫国立

1)河南中医药大学基础医学院公共卫生与预防医学学科 郑州 450046 2)郑州大学第三附属医院医务部 郑州 450052 3)河南大学护理学院 河南开封 475004

慢性氟中毒主要引起氟斑牙和氟骨症。随着人们对氟中毒发病机制认识的不断提高，已明确慢性氟中毒是一种全身性疾病，可造成机体多系统的毒性损伤[1]。近年来，氟暴露对神经系统的影响和作用机制研究受到了广泛的关注，氟对海马细胞结构的影响以及相关基因的表达已有研究报道[2-4]。但有关N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)对氟诱导雄性大鼠海马细胞凋亡及ATF-6蛋白表达的影响很少见报道。NAC由L-半胱氨酸加上乙酰基形成，是细胞内还原型谷胱甘肽的前体。NAC分子中含有活性巯基，对体内超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等氧自由基具有明显的拮抗作用，可对抗不同原因所致的氧化损伤[5-6]。本研究选用雄性SD大鼠经灌胃染毒建立氟中毒模型，同时给予抗氧化剂NAC加以干预，通过大鼠海马体质量、海马组织氟含量、海马细胞凋亡和海马组织ATF-6蛋白表达水平检测，观察NAC对氟诱导大鼠上述指标的影响，为预防氟对海马细胞的损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器氟化钠(NaF)购于天津市光复精细化工研究所；NAC购于美国Sigma公司；盐酸购于北京化工厂；二甲苯、乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司；苏木素染色液购于南京建成生物工程研究所；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、ATF-6多克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP均购于南京凯基生物科技发展有限公司。电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；组织匀浆器(海门爱苯德)；高速离心机(美国Sigma公司)；氟离子选择电极(上海电元器件厂)；亚光YB-7B石蜡包埋机(泰维电子有限公司)；LEICAASP200自动切片机(LEICA公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2实验动物分组及处理4～5周龄、体重在80～100 g之间的雄性健康SD大鼠48只，由河南省实验动物中心提供，动物合格证编号：SCXK(豫)2010-0002。动物饲养在SPF级实验动物房。大鼠检疫1周无异常后，进行称重并编号，采用随机数字表法将其分为对照组、NaF组、NaF+NAC组和NAC组，每组12只。对照组给予生理盐水[10 mL/(kg·d)]；NaF组给予NaF溶液[25 mg/(kg·d)]；NaF+NAC组给予NaF溶液[25 mg/(kg·d)]+NAC溶液[150 mg/(kg·d)]；NAC组给予NAC溶液[150 mg/(kg·d)][7-9]。每周连续灌胃6 d后停灌1 d，共灌胃7周。

1.3海马体质量测定大鼠染毒7周后，采用水合氯醛腹腔注射麻醉并处死，按照《大鼠脑立体定向图谱》取大脑海马体，剥离干净称量。

1.4海马组织氟含量测定采用酸浸-氟离子选择电极法[10]。先制备海马组织标本，再通过酸浸提取15 mL离心液，使用标准曲线法测定海马组织氟含量。

1.5海马细胞凋亡检测先将海马组织石蜡切片脱蜡至水化，再使用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测。染色后将切片置于400倍光镜下观察，蓝紫色为正常细胞，棕色为凋亡细胞。每个样本制备3张切片，每张切片镜检500个细胞，凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.6海马组织ATF-6蛋白水平检测采用免疫组化法检测大鼠海马组织中ATF-6蛋白的表达情况。海马组织石蜡切片脱蜡后，用体积分数3%双氧水处理10 min，不锈钢压力锅中加入1 500～3 000 mL pH=6.0的枸橼酸盐缓冲液对切片进行热修复组织抗原，PBS洗涤。BSA封闭液室温封闭20 min。依次滴加1100 ATF-6抗体(4 ℃过夜，PBS洗涤)、二抗IgG(37 ℃水浴30 min，PBS洗涤)。DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。利用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件在400倍视野下测定光密度值，每张切片选取5个视野，取其平均值作为ATF-6蛋白的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行分析。不同组间海马体质量、海马组织氟含量、海马细胞凋亡指数和海马组织中ATF-6蛋白表达水平的比较均采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠海马体质量和海马组织氟含量比较

NaF可减少海马体质量，NAC可增加海马体质量，NaF和NAC对海马体质量的交互作用差异有统计学意义； NaF可升高海马组织氟含量，NAC可降低海马组织氟含量，NaF和NAC对海马组织氟含量的交互作用差异有统计学意义，见表1。

2.2各组大鼠海马细胞凋亡指数和海马组织中ATF-6蛋白表达水平比较NaF可升高海马细胞凋亡指数和海马组织中ATF-6蛋白相对表达量，NAC可降低海马细胞凋亡指数和海马组织中ATF-6蛋白相对表达量；NaF和NAC对海马细胞凋亡和海马组织中ATF-6蛋白相对表达量的交互作用差异有统计学意义，见表2。

表1 各组大鼠海马体质量和海马组织氟含量比较

表2 各组大鼠海马细胞凋亡指数和海马组织中ATF-6蛋白表达水平比较

3 讨论

3.1各组大鼠海马体质量和海马组织氟含量分析

该研究结果显示，NaF可减少海马体质量，究其原因可能是NaF对海马细胞造成损伤，引起细胞数量减少，细胞出现空泡[11]。NAC可增加海马体质量，而且结果提示NAC可拮抗NaF对海马细胞的损伤，可能原因是NAC可降低细胞氧化损伤，提高细胞活性[12]。NaF可升高海马组织氟含量，说明氟可在海马组织中蓄积，并成为氟对海马细胞损伤的物质基础，与王瑞等[13]研究结果一致。NAC可降低海马组织氟含量，而且结果提示NAC可拮抗NaF在海马组织中蓄积，该结果还需进一步研究来论证。

3.2各组大鼠海马细胞凋亡分析细胞凋亡是维持内环境稳定，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用的细胞自主的有序死亡。本研究结果显示，NaF可升高海马细胞凋亡指数，说明NaF可诱导海马细胞凋亡，与马小惠等[14]研究结果一致。NAC可降低海马细胞凋亡指数，而且结果提示NAC可拮抗NaF诱导海马细胞凋亡。分析原因认为，NAC作为一种含巯基的抗氧化剂，能干扰活性氧，清除生成的自由基，调节细胞的代谢活性，抑制细胞凋亡及炎症反应，并在一系列信号转导、基因表达中起重要作用[12,15]。

3.3各组大鼠海马组织中ATF-6蛋白表达水平分析细胞凋亡信号通路一般可分为3类：线粒体损伤途径、死亡受体活化途径以及内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途径。其中ERS是近年来发现的一种启动凋亡的新途径。内质网是新生蛋白折叠的地方，当外界环境发生改变，出现炎症、氧化应激等刺激时，内质网功能紊乱，未折叠蛋白就会在内质网中积聚并引发未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)[16]。UPR可以加速处理未折叠的蛋白或错误折叠的蛋白，以便更好地维持细胞的正常生理功能。假如这种损伤长期进行下去，就会使细胞的内环境稳态得不到及时恢复，势必引起细胞凋亡，信号由促生存向促凋亡转换[17]。ERS发生时，UPR可激活3种转录因子，ATF-6是其中之一[18]。ATF-6蛋白可以触发ERS相关的促凋亡信号通路。本研究结果显示，NaF可升高海马组织中ATF-6蛋白相对表达量，说明NaF可诱导大鼠海马细胞发生ERS，UPR激活ATF-6转录因子，ATF-6蛋白表达量增高。NAC可降低海马组织中ATF-6蛋白相对表达量，而且结果提示NAC可抑制NaF诱导的海马组织中ATF-6蛋白相对表达量的增高，与闫婷[9]的研究结果相似。

综上所述，NAC能够保护海马细胞避免NaF引起的凋亡损伤，也能拮抗NaF诱导海马细胞发生ERS导致的ATF-6蛋白表达的上调。提示NaF可诱导海马细胞发生ERS，继而引起其发生凋亡。