我国水稻纹枯病菌的融合类群及致病性差异

王爱军，王娜，顾思思，赵文娟，李平，郑爱萍*

(1.四川农业大学水稻研究所，四川 温江 611130；2.四川农业大学西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室,四川 雅安 625014；3.四川农业大学风景园林学院，四川 温江 611130)

水稻(Oryzasativa)是我国重要的粮食作物之一，有65%的人口以稻米为主食，在粮食生产中具有十分重要的地位[1]。水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一种世界性水稻病害[2]，该菌可形成抗逆性强的菌核结构，在土壤中存活时间较长，发病时还可通过植物叶片横向传播，是一种具有土传和叶传双重特性的半腐生真菌，可侵染多种寄主，一般在水稻分蘖期高温、高湿条件下发生侵染[3-5]。近年来，随着水稻高产、多蘖、粗秆大穗型栽培种的推广，过量施用氮肥以及种植密度的加大，使田间通风差、湿度大，为纹枯病菌侵染提供了有利的环境条件[6-7]。由水稻纹枯病菌侵染造成的病害损失达10%～50%[8-9]，且有逐年加重的趋势，已发展成为制约我国水稻高产的主要病害，严重威胁我国的水稻生产[10]。

根据立枯丝核菌菌丝能否互相融合，将其划分为至少14个融合群(anastomosis groups, AGs)，有些融合群可进一步划分为融合亚群[11]。近年来，相关学者对我国江苏[12]、湖北[13]、四川[14]、广东[21]等地水稻纹枯病菌的致病力分化和融合群进行了广泛研究，并取得了一些进展。然而，全国范围内的水稻纹枯病菌致病力分化情况以及引起其致病力分化的可能因素尚未见报道。因此，从16个水稻主要种植区采集与水稻纹枯病症状类似的植株，进行纹枯病病原菌的分离，基于其形态学特性、菌丝细胞核荧光染色和 rDNA-ITS 序列分析进行鉴定和比较，并采用柯赫氏法则对分离自16个不同区域的病原菌致病力分化进行测定，旨在明确水稻纹枯病菌的生物学特性、致病力分化与地理来源之间的关系，为有效地预测预报和防治该病害提供一定的理论依据；同时寻找新的、致病力差异较大的菌株，为纹枯病菌与其寄主互作研究提供更加丰富的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病株：于2015年8月，采集自黑龙江、吉林、辽宁、河南、安徽、浙江、江苏、四川、重庆、贵州、云南、湖北、湖南、广西、广东、福建16个水稻种植区纹枯病样品34份。不同菌株的致病性测定试验使用9311水稻品种。

PSA固体培养基：2%蔗糖、1.8%琼脂粉、20%马铃薯，121 ℃灭菌20 min；PSA液体培养基：20%马铃薯、2%蔗糖，121 ℃灭菌20 min；WA培养基：1.5%琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1病样采集及病原菌的分离 于2015年8月，分别从黑龙江等16个水稻纹枯病自然发病田中采集水稻病鞘或病叶样本，每个采样田块采用对角线5点采样法进行采样，混合分装进行纹枯病病原菌的分离，并描述发病样本症状。病原菌的分离采用水琼脂分离法[15]，用消毒后的剪刀剪取每个样品病斑边缘长宽约5 mm的病样组织，75%的酒精消毒2 min，无菌水冲洗3次，置于装有1/3灭菌蒸馏水的培养皿中，于28 ℃恒温培养箱中培养24 h；用镊子夹取病样组织块在灭菌滤纸上吸干表面水分，平铺于WA培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养48 h；当病样组织块周围长出2～3 cm、呈分枝状的菌丝时，用接种铲在单个菌丝尖端切取3～4 mm左右的菌块转接到PSA培养基上进行菌落纯化，每隔1 d观察菌丝生长情况。所有的操作均在超净工作台中进行。

1.2.2形态学鉴定 将分离到的菌株接种于PSA平板上活化，待菌落长至平板边缘时，用打孔器在菌落边缘打取直径为5 mm的菌丝块，接种于另一洁净的PSA培养基中央，置于28 ℃恒温培养箱中培养，每个菌株重复3皿。每隔2 h按十字交叉法测量菌落生长直径，期间观察菌丝的生长形态、菌核形成时间及颜色变化等。

选择干净无划痕的载玻片，蒸馏水冲洗干净，擦干后于121 ℃高压灭菌20 min，适度烘干后，放入95%乙醇浸泡脱水，取出载玻片，用火焰去除乙醇，冷却后立即插入分离自不同地区水稻纹枯病菌生长的培养皿中，28 ℃恒温培养箱中培养24 h，待菌丝生长到载玻片1/2处，取出载玻片，滴取适量浓度为100 μg·mL-1的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)荧光染液于载玻片的菌丝上，盖上盖玻片，染色30 min，试验在黑暗条件下进行；染色完成后取下盖玻片，快速用1×PBS或蒸馏水冲洗干净，以除去未结合的染液，用灭菌滤纸吸去多余水分，滴加1滴荧光封片液(0.5 mol·L-1磷酸盐缓冲液与灭菌的80%甘油等体积混合)，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下蓝光通道，观察菌丝形态和细胞核形态，并统计不同菌株的细胞核数[16]。

1.2.3分子生物学鉴定 分子生物学鉴定 为鉴定分离到的病原菌菌株以及纹枯菌融合亚群归属，对分离自16个不同地区的61株病原菌进行rDNA-ITS序列分析。采用CTAB法提取病原菌基因组DNA[17]。rDNA-ITS序列引物为F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′； R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反应体系采用50 μL体系：2 μL DNA模板，10 μL FastPfu Fly Buffer，5 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，1 μL FastPfu Fly 高保真酶，正反引物各1 μL，用ddH2O补充至50 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。

1.2.4病原菌致病性测定 采用离体叶片接种法进行病原菌的致病性测定。接种材料为水稻9311品种，选取水稻剑叶，均匀地平铺于装有湿润滤纸的白色瓷盘上；随机选取分离自16个不同地区的水稻纹枯病菌各1株活化，待菌落长至平板边缘时，用打孔器在菌落边缘打取直径为5 mm的菌丝块，接种到瓷盘中放置好的叶片中部，接种后覆盖上保鲜膜保湿，置于28 ℃恒温光照培养箱中，每天及时往瓷盘中添加无菌蒸馏水保证叶片的湿润环境；每株菌重复3次，以不接菌丝块的健康叶片为对照，于接种后24、48、72、96 h观察叶片发病情况，并统计叶片病斑大小及侵染叶面积百分比。

2 结果与分析

2.1 水稻纹枯病的为害症状

纹枯病菌主要为害叶鞘，严重时也可为害叶片、茎秆和穗部，整个生育期均可发生。发病初期，叶鞘表面出现暗绿色水渍状斑点，随后扩大，形成有暗褐色边缘的椭圆形病斑，后多个病斑重叠成中央灰白色或草绿色，边缘明显的云纹状。潮湿时病部出现白色粉状霉层，后形成褐色菌核。高温、高湿等环境条件可促使纹枯病的发生，发病后输导组织破坏，谷粒饱满度减小，甚至不能正常抽穗，形成大量瘪谷。

2.2 水稻纹枯病的分离及形态学特征

2.2.1病原菌的分离 采用水琼脂分离法分离得到的菌株，菌丝经过单菌丝尖端移植，转到PSA培养基上纯化。从黑龙江等16个不同地区共分离得到61株病原菌菌株(表1)。病原菌菌丝细而松散，多分枝，分枝为直角或接近45°的锐角，菌落后期基质颜色变褐，产生多个菌核。

表1 水稻纹枯病菌的分离Table 1 The isolates of the rice sheath blight pathogen

2.2.2病原菌菌落形态 观察分离自16个不同地理来源的病原菌菌株在PSA培养基上的生长变化情况(图1)，接种后2 h菌丝开始沿菌丝块周围生长，不断蔓延，菌丝初期细且密，呈白色；24 h后，菌丝生长到整个培养基的2/3，菌丝在加快生长的同时开始不断稠密变粗；48 h后，菌丝长满整个平板，产生少量气生菌丝，部分菌丝聚集成团，形成少量白色菌丝团；72 h后，气生菌丝不断增多，菌丝层上形成厚密的白色菌丝团，来源于广东的菌株GD、广西的菌株GX和河南的菌株ZZYY最先形成明显白色颗粒状的菌核；96 h后，菌丝逐渐变为黄褐色，GD菌株产生少量黄褐色菌核，其他菌株可见白色菌核；7 d后，菌丝颜色加深，形成大量深褐色菌核分散于培养皿中，其中菌株GD和菌株GX形成的菌核大且圆，菌核之间不相连，而湖南的菌株HN形成的菌核多集中在接种点周围，来源于浙江的菌株HZFY、辽宁的菌株SY、安徽的菌株AH菌核形成时间缓慢，数量明显少于其他菌株，说明不同地理来源的菌株具有一定的差异。

图1 不同来源的病原菌菌落形态Fig.1 The colony morphology of strains isolated from different area

对分离自16个不同地理来源的61株病原菌菌株生长速率进行测定，结果表明大多数菌株生长过程比较规律，平均生长速率基本一致，为0.21～0.23 cm·h-1。在生长早期，GD菌株生长较慢，生长速率仅为0.19 cm·h-1，但10 h后菌丝生长加快，达到0.33 cm·h-1，其菌丝生长最快，平均速率为0.24 cm·h-1。而HN和CC菌株生长相对较慢，平均生长速率分别为0.17和0.18 cm·h-1。

2.2.3病原菌菌丝形态 细胞核经DAPI染色、荧光显微镜成像观察菌丝及细胞核形态，结果发现，分离自16个不同地区的61个菌株细胞核在DAPI染色下均能清晰可见，基本无重合；菌丝多分枝，分枝处菌丝之间近直角或锐角，分枝处有溢缩，且分枝处多隔膜，隔膜将菌丝分成若干个单细胞，大多数细胞是多核的(图2)。每个菌株计数约200个单细胞，对61株病原菌菌株细胞核的数量统计发现(表2)，大多数菌株的细胞核集中在6～8个，HB、GD、和AH菌株的细胞核数量偏多。但GD菌株均匀分布在菌丝的各个部位(图2a)，而AH菌株的细胞核主要集聚在一起(图2d)，菌丝分枝均较多。而CC菌株的细胞核明显偏少，菌丝分枝少(图2c)，这可能与菌株生长的环境及地理条件有一定的关系。此外，菌丝与菌丝之间常发生融合现象(图2b)，这可能是菌丝细胞形成多核的原因之一。

图2 菌丝细胞核DAPI染色观察Fig.2 Karyological observation of secondary mycelium with DAPI a, c, d：菌丝被隔膜分为多细胞菌丝(箭头)及每个细胞的细胞核数；b：菌丝的融合。a, c, d：The hyphae were separated into multicellular mycelia by septum (arrows), and nuclear number in per cell；b：Hyphal fusion (arrows). 标尺Bars: 20 μm.

菌株编号Strain ID细胞核数量Number of cell nucleus菌株编号Strain ID细胞核数量Number of cell nucleusGD4～14,大多数Most 7～10FM3～10,大多数Most 6～7GX5～12,大多数Most 6～8HN3～10,大多数Most 5～7ZZYY4～11,大多数Most 5～7WC4～9,大多数Most 6～8CQ4～14,大多数Most 6～9WJ4～14,大多数Most 6～8FJ4～13,大多数Most 6～7CC3～9,大多数Most 4～6NJ5～14,大多数Most 6～8HZFY4～12,大多数Most 6～8GZ5～13,大多数Most 7～8SY3～8,大多数Most 4～5HB5～19,大多数Most 7～10AH4～18,大多数Most 8～12

2.3 病原菌分子鉴定

以ITS序列引物对分离得到的61株病原菌基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测得到大小均为750 bp左右的条带(图3)，扩增产物回收后进行克隆，对单克隆的菌液进行测序，将测序结果在NCBI上使用nucleotide blast工具分析比对，结果显示该61株菌株与RhizoctoniasolaniKX674518的同源性达到100%。利用MEGA 6软件对立枯丝核菌不同融合群及分离菌株ITS序列进行聚类分析，绘制分析系统树，结果显示所分离得到的菌株均与RhizoctoniasolaniAG1IA聚为一类(图4)，表明分离到的61株菌株均是Rhizoctoniasolani,且属于AG1IA融合群。

2.4 病原菌致病性测定

图3 纹枯病分离菌株ITS-PCR扩增电泳图Fig.3 PCR amplification of the ITS sequence of R. solani isolates M:DNA marker.

图4 对立枯丝核菌不同融合群及分离菌株ITS序列的聚类分析Fig.4 Clustering analysis of ITS sequence of different R. solani isolate strains

通过离体水稻叶片接种GD、GX、ZZYY、CQ、FJ、NJ、GZ、HB、FM、HN、WC、WJ、CC、HZFY、SY和AH 16株病原菌进行致病性测定，结果表明16株病原菌均能引起水稻叶片发病，且引起的症状特点基本一致，均产生云纹状病斑纹枯病典型症状。采用水琼脂分离法从发病叶片中再次分离病原菌，经鉴定与原接种物一致。

对不同地理来源的16株病原菌菌株致病性进行了测定，接种24 h后病原菌菌丝在叶片上大量蔓延伸展，接种菌株GX、FJ、NJ的叶片首先出现较小的褐色病斑；48 h后接种大部分菌株的叶片均开始产生水纹状病斑，GD菌株产生3个左右病斑，较其他的菌株多，菌株GX最先形成云纹状的大病斑，病斑中间部位呈灰白色，边缘呈棕褐色，病斑已延伸至菌丝块周围2 cm处，菌株FJ、HZFY、NJ、CQ、ZZYY、WJ、GZ、FM、CC、HB、WC和HN也开始产生1～2个较小的边缘清晰可见的病斑，而菌株SY、AH未产生病斑；72 h后接种菌株SY、AH的叶片开始产生第一个病斑，大部分菌株产生的病斑开始增多且在叶片上扩散，比较而言，菌株HZFY产生的病斑少且小，只分布在菌丝块周边，没有扩散；接种侵染96 h后对不同菌株侵染的叶片病斑大小及占叶面积的百分比进行统计(图5)，结果表明菌株GD、GX侵染的叶片病斑大，病斑颜色较深，病斑遍布大半张叶片，导致叶片从接种点至叶尖局部变为黄色，致病力较强，而CC、WC、WJ、AH、SY、HZFY菌株侵染产生的病斑较小，多集中在接种点周围，零星分布，没有扩散至整个叶片，叶片没有变黄的迹象，致病力相对较弱。

图5 不同菌株感染水稻叶片96 h后发病情况Fig.5 The pathogenicity comparison of different strains infecting the rice leaves for 96 hours later

3 讨论

本研究首次从我国各水稻种植区采集分离水稻纹枯病病原菌。研究了不同地理来源的纹枯病病原菌在人工培养基上的菌丝生长差异及菌落形态变化。结果表明，生长后期产生的褐色菌核结构是其典型菌落特征。大部分菌株之间平均生长速率差异不大，部分菌株具有一定的差异。形成的菌核分为大且圆，菌核之间不相连和集中在接种点周围两种类型。

Flentje等[17]曾报道过R.solani核的分布情况，且真菌细胞核数量变化也可以作为菌种的分类标准。本实验用荧光染料DAPI染色纹枯病病原菌菌丝，对其细胞核进行了观察。结果表明菌丝体细胞为多核，不同地理来源的菌株细胞核数量具有明显差异，来源于黑龙江、辽宁、吉林等地的菌株细胞核数量较其他地区少，可能由于北方的地理环境，使得菌丝生长适宜条件的持续时间少，菌丝进化的速度慢于高温高湿地区的菌株。

ITS是真菌核糖体DNA 18S和28S基因之间的序列片段[18]，能鉴定真菌属、种之间的碱基差异[19]。陈雨等[20]利用ITS序列分析对田间早期不显症的水稻稻粒黑粉病样本进行发病监测，可提早预知该病的发生，并进行合理的防控，减轻病害损失。本试验利用ITS序列分析对分离到的61株病原菌菌株进行了融合群测定，结果表明61株菌株均与RhizoctoniasolaniAG1IA聚为一类，说明分离到的61株菌株均属于AG1IA融合群，这与Kuninaga等[21]和李华荣[22]的研究结果一致。也有报道从水稻上分离到了AG1IB、AG1IC融合群菌株，但以水稻为寄主的主要是AG1IA融合群。

使用分离到的病原菌菌株回接试验表明，不同地理来源的病原菌菌株均侵染水稻叶片，并产生云纹状病斑的纹枯病症状，进一步从柯赫氏法则的角度对分离菌株进行了鉴定[23]。分离自不同地区的纹枯病病原菌致病力不同，其中来源于广东、广西、福建、重庆等地的菌株致病力较强，而黑龙江、吉林、辽宁等地区的菌株致病力较弱，由于纹枯病在高温高湿条件下发病较重，而南方稻区高温高湿的环境条件正好为病原菌的侵染循环提供了良好的媒介，因此不同地理来源的菌株其致病力有明显差异，这与周而勋等[24]的研究相一致，说明在不同的生态环境下，同一菌群的菌株间由于受地理环境影响，可能出现较大的遗传差异，而这些遗传差异可能是导致其致病力不同的原因。

致病力较强的广东、广西等地菌株最先开始形成褐色菌核，在后期生长过程中菌核大且完整，菌核间不相连，使用菌核接种时，萌发时间短，菌丝生长速度较快，而对于致病力较弱的辽宁、安徽、浙江等地菌株不仅形成菌核时间晚，而且最终形成的菌核小、数量少。表明病原菌致病力与其菌核数量及结构相关，这与邹成佳等[25]对华南三省区水稻纹枯病菌致病力测定所得的结论不同，他们认为菌核数量与其致病力之间没有直接联系，但作为重要侵染源，菌核数量的多少也是影响病害发生的一个重要因素，这可能是由于病原菌分布的地域较近，菌核数量和形态差异不大。对不同地理来源立枯丝核菌致病力的测定、细胞核及生长状况的观察，有助于了解同一种属不同分离菌的生物学差异，进一步揭示立枯丝核菌的演化历史、进化机制以及适应环境等问题，以期从遗传背景上找到病原菌致病力分化的原因，为防控该病害提供新的策略。