慢性情绪应激对急性心肌梗死后骨髓c-kit+干细胞动员的影响

王超，杜泓森，侯季秋，燕莎莎，王昀，赵海滨

焦虑、抑郁等慢性情绪应激作为常见的精神心理疾病，已成为影响生活质量的首要病因。作为冠心病发生、发展的独立危险因素，焦虑、抑郁在冠心病患者中的发病率约30%，合并焦虑、抑郁的冠心病患者重度心力衰竭、恶性心律失常等并发症的发生率明显高于非焦虑、抑郁人群[1]。研究显示，急性心肌梗死发生后，坏死的心肌诱发炎症反应，而炎症反应激活可能是连接慢性情绪应激与心肌梗死病理进程的关键途径。炎症反应可动员骨髓c-kit+干细胞释放入血并迁移至梗死部位发挥心肌修复的作用，但过于剧烈的炎症反应则可抑制骨髓c-kit+干细胞动员并促进其凋亡[2-5]。那么焦虑、抑郁等慢性情绪应激是否可放大心肌梗死后的炎症反应？双重因素导致的炎症状态对骨髓c-kit+干细胞的动员有何影响？核转录因子-κB（NF-κB）信号通路作为炎症反应的起始环节，在其中是否发挥作用？本文研究了慢性情绪应激对心肌梗死后骨髓c-kit+干细胞动员的干预效应，并初步探讨了与NF-κB介导的炎症反应的可能相关机制。

1 材料与方法

研究资料：健康SPF级雄性SD大鼠，体重170～190 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京中医药大学SPF级动物房。实验试剂及仪器：c-kit+-PE、c-kit+-APC流式抗体（北京博奥森生物技术有限公司），NF-κB 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司），流式细胞仪（美国BD公司），小动物呼吸机（上海奥尔科特生物技术有限公司），小动物超声影像系统（加拿大Visual Sonics公司），全自动三导联心电图（美国BD公司）。

建模方法及分组：本研究采用两种慢性情绪应激方案，分别建立焦虑和抑郁的慢性情绪应激模型，并与冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死模型相结合，分别建立心肌梗死合并焦虑、心肌梗死合并抑郁的大鼠模型。根据随机数字表将动物分为假手术组、心肌梗死组、心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组，每组6只。

心肌梗死模型建立：大鼠经1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，经口连接气管插管后接小动物呼吸机。于左侧肋骨第三、四肋间打开胸腔，用5-0带线缝合针结扎左侧心耳下2 mm部位。术后腹腔注射0.2 ml利多卡因以防止心律失常，40万单位青霉素预防术后感染。以术后第二天心电图Ⅰ、aVL、V1～V6导联中有6个以上导联出现病理性Q波为心肌梗死成功标志。假手术组穿线后打松结，其余步骤相同。

不确定空瓶刺激法建立焦虑模型：参照文献[6]，建模周期共21天，建模期间大鼠自由饮食。第1～7天每天9:00～9:10和21:00-21:10早晚分两次给予饮水，其余时间禁水让大鼠处于口渴状态。第8～21天每日早晚随机一个时间段给予空瓶，另一个时间段喂水。

孤养+慢性不可预知性应激建立抑郁模型：参照文献[7]，建模周期共21天。建模期间每只大鼠单笼饲养，同时禁食、禁水、夹尾巴、昼夜颠倒、潮湿垫料、鼠笼倾斜、束缚七种刺激每天随机选择一种进行刺激，每种刺激共进行3次。

于慢性情绪应激建模的第15天对大鼠实施心肌梗死手术，建模第22天对动物进行超声心动图检查及行为学测试后处死动物，取外周动脉血、心脏以及大脑。

超声心动图检测：大鼠经1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，仰卧固定，左胸前备皮，取左心室短轴切面，探测M型曲线，每只鼠取3个连续心动周期，记录大鼠的左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、左心室收缩末期容积（LVESV）和左心室舒张末期容积（LVEDV）。

旷野试验（OFT）：试验装置为100 cm×100 cm×40 cm的木制箱，底板有25个方格（20 cm×20 cm），正上方2 m处有一个摄像系统，其视野可覆盖整个旷场内部。将大鼠放在中央格后，开始计时并摄像，共计3 min。记录大鼠在旷场箱内水平运动得分（每越过一个格子记1分）以评价大鼠的水平运动能力，记录大鼠垂直运动得分（每直立一次记1分）以评价大鼠的垂直运动能力。

高架十字迷宫（EPM）：试验装置由两条相对开放臂（50 cm×10 cm）和两条相对闭合臂（50 cm×50 cm×10 cm）及中央区（10 cm×10 cm）连接而成，距离地面50 cm。将大鼠从中央格面向开放臂放入，记录5 min内的活动情况。记录大鼠在开放臂停留的时间（OE），进入开放臂的次数（OT），在闭合臂停留的时间（CE），进入闭合臂的次数（CT）以评价动物焦虑程度，计算 OE/（OE+CE）以及 OT/（OT+CT）的比值。

强迫游泳（FST）：试验装置为一个直径20 cm、高46 cm的圆形透明有机玻璃筒，水深20 cm左右以大鼠挣扎过程中后爪刚好离开桶底为宜，水温24℃左右。将大鼠放入游泳池中，使其自由游泳6 min，记录大鼠在后四分钟内漂浮在水面不动的时间。

HE染色及Masson染色：大鼠麻醉后，打开胸腔，自左心室插入灌流器用10%中性福尔马林溶液灌注固定，摘取心脏和大脑浸泡于10%中性福尔马林溶液48 h后制备石蜡切片，心脏切片行Masson染色及HE染色，大脑切片行HE染色。

ELISA法检测外周血NF-κB含量：参照文献[8]，大鼠麻醉后，腹主动脉采血置于含促凝剂的采血管中，静置30 min，600 g离心15 min，取血清，根据ELISA试剂盒说明书步骤进行指标检测。

流式细胞术检测骨髓和外周血c-kit+干细胞数量：大鼠麻醉后，腹主动脉采血置于含乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管，加入红细胞裂解液裂解红细胞，加入c-kit+-APC荧光抗体孵育，磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH=7.4）清洗并重悬后上流式细胞仪检测外周血c-kit+干细胞数。分离大鼠股骨，在骨骺端剪开一小缺口插入10 ml注射器，用PBS冲出骨髓，加入红细胞裂解液，加入c-kit+-PE荧光抗体孵育，PBS清洗并重悬后上流式细胞仪检测骨髓c-kit+干细胞数。

统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理。各组数据经正态性检验和方差齐性检验，若数据符合正态分布，计量资料采用均数±标准差表示，若方差齐则采用单因素方差分析，方差不齐时采用Welchi检验，必要时采用LSD检验进行两两比较；若不符合正态分布，计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用非参数检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图指标的比较（图1）

图1 各组大鼠超声心动图指标的比较（n=6）

心肌梗死组、心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死

2.2 各组大鼠的动物行为学指标比较（图2）

旷野试验结果显示，相比于心肌梗死组，心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组的大鼠水平运动得分和垂直运动得分减少，活动能力下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。高架十字迷宫试验结果显示，相比于心肌梗死组，心肌梗死合并焦虑组大鼠倾向于待在闭合臂里，差异具有统计学意义（P＜0.05）。强迫游泳试验显示，相比于心肌梗死组，心肌梗死合并抑郁组大鼠水中不动时间延长，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠病理染色结果的比较（图3）

大脑HE染色结果示：假手术组大鼠的大脑海马CA3区细胞排列整齐，连接紧密，细胞质淡粉着色；心肌梗死组大鼠的大脑海马CA3区细胞排列稍显紊乱，心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组大鼠的大脑海马CA3区细胞排列紊乱明显，部分细胞质染色不均。心肌HE染色结果示：假手术组大鼠的心肌细胞结构正常，肌纤维排列整齐规则，肌丝清晰；心肌梗死组、心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组大鼠的心肌肌纤维断裂，核碎裂，心肌细胞数量减少，间质纤维化增多。心肌Masson染色结果示：假手术组心肌纤维红染，肌细胞排列整齐，横纹可见，未见明显胶原纤维；心肌梗死组、心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组心肌细胞排列紊乱，心肌横纹消失，肿胀并伴有数量减少，组织间质可见显著胶原纤维及炎性浸润，梗死部位可以见空泡样改变，胶原纤维呈弥散样分布。

图2 各组大鼠行为学指标比较（n=6）

图3 各组大鼠心肌、大脑组织HE染色（×400）和Masson染色（×400）结果

2.4 各组大鼠外周血NF-κB含量的比较（图4）

ELISA结果显示， 心肌梗死合并焦虑组、心肌梗死合并抑郁组大鼠的NF-κB含量高于心肌梗死组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 酶联免疫吸附法测定各组大鼠外周血NF-κB含量（n=6）

2.5 各组大鼠的骨髓和外周血c-kit+干细胞数量比较（图5）

相比于心肌梗死组，心肌梗死合并焦虑组大鼠骨髓合并抑郁组的LVEF和LVFS低于假手术组，LVEDV和LVESV高于假手术组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。心肌梗死合并焦虑组和心肌梗死合并抑郁组的LVEF和LVFS低于心肌梗死组，LVEDV和LVESV高于心肌梗死组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。c-kit+干细胞数减少，心肌梗死合并抑郁组大鼠外周血c-kit+干细胞数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 流式细胞术比较各组大鼠骨髓和外周血c-kit+细胞数量（n=6）

3 讨论

本研究采用经典的结扎冠状动脉左前降支方法建立心肌梗死模型，采用不确定空瓶刺激法建立焦虑模型，采用孤养+慢性不可预知性刺激建立抑郁模型。目前对焦虑或抑郁的评价多采用经典的行为学评价。焦虑动物表现为对高架十字迷宫中开放臂的探究次数减少以及停留时间减少，旷场实验中水平或者垂直运动能力下降。抑郁动物表现为在旷场实验中水平或者垂直运动能力下降低以及在强迫游泳实验中漂浮时间增加[7]。本研究结果证明，心肌梗死、心肌梗死合并焦虑以及心肌梗死合并抑郁等动物模型成功建立，可用于心肌梗死合并焦虑或抑郁的疾病研究。

c-kit+干细胞能够修复损伤的心肌，但是由于心脏源性干细胞数量较少难以达到理想修复效果。心肌梗死发生后，坏死的心肌组织刺激机体释放的NF-κB等炎症因子可动员自身干细胞迁移至心肌梗死部位，该过程在心肌梗死发生3～7天后达到高峰，其中约有74%的c-kit+干细胞来源于骨髓[9-12]。而过度增加的NF-κB可介导白细胞与内皮间的黏附反应促进骨髓干细胞的凋亡[3]。因此，NF-κB介导的炎症反应是骨髓干细胞动员的双刃剑，在一定范围内，炎症反应可促进骨髓c-kit+干细胞动员，而当炎症反应增强到某个程度，则会减弱甚至抑制骨髓c-kit+干细胞的动员。

本研究结果显示，相比于心肌梗死组大鼠，心肌梗死合并焦虑组和心肌梗死合并抑郁组的大鼠血清NF-κB的含量升高，且心功能明显减退，证明了焦虑抑郁导致心肌梗死后心功能的恶化，并加重心肌梗死发生后的炎症反应。此外，相比于心肌梗死组大鼠，心肌梗死合并焦虑组及心肌梗死合并抑郁组的大鼠骨髓或外周血c-kit+细胞数量均存在不同程度下降，证明焦虑或抑郁可增加心肌梗死后NF-κB的含量，抑制c-kit+干细胞的动员。

综上所述，采用不确定空瓶法联合冠状动脉左前降支结扎法可建立急性心肌梗死合并焦虑的大鼠模型，采用孤养+慢性不可预知性刺激联合冠状动脉前降支结扎法可建立急性心肌梗死合并抑郁大鼠模型。焦虑、抑郁可抑制心肌梗死发生后骨髓c-kit+干细胞的动员，且这一过程可能与炎症反应增强有关。本研究揭示了焦虑、抑郁影响冠心病预后的部分机制，但仍需从细胞实验角度对本研究结论进行验证。