不同年龄段感音神经性聋患者谷氨酸受体7基因多态性分析△

王文涛 陈贤明 谢三林 郭文玲

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可能引起蛋白质表达的质或量的变化，这种变化可能与某些疾病的发生或易感性相关。谷氨酸是听觉系统重要的神经递质，代谢型谷氨酸受体在中枢神经系统分布广泛，在听觉系统，代谢型谷氨酸受体分布于内外毛细胞以及内耳螺旋神经节的神经细胞。有研究利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)发现欧洲老年人群感音神经性聋与代谢型谷氨酸受体7(GRM7)基因的SNPs密切相关[1]；中国汉族老年男性感音神经性聋患者也被发现与GRM7基因SNPs显著相关，并且不同听力下降类型者的基因多态性也存在差异[2]。上述研究对象均是50岁以上感音神经性聋患者，较低年龄段的感音神经性聋是否也与GRM7基因SNPs有相关性尚不清楚。为此，本研究选取年龄30～70岁的感音神经性聋患者，分为30～50岁和51～70岁两个年龄段组，分析各组GRM7基因相关位点，并与相同年龄段正常听力人群比较，探讨不同年龄段感音神经性聋患者GRM7基因SNPs是否存在差异及其与年龄的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 研究对象纳入标准：年龄30～70岁，感音神经性聋组耳聋特征符合双耳对称性听力下降，初次就诊，原因不明，言语频率(500、1 000、2 000 Hz)平均听阈≥26 dB HL，气骨导差<10 dB。对照组为同龄段成年人，均为同期进行健康体检者，耳科常规检查无异常，言语频率平均听阈≤25 dB HL。排除标准：有外耳道、中耳疾病，有明确的长期噪声暴露史，有耳毒性药物接触史，突发性聋、梅尼埃病等；ABR检查怀疑有蜗后病变者；伴有严重全身性疾病，如：糖尿病、高血压、心脏疾病、高脂血症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病等。选取符合纳入及排除标准的906例汉族成年人感音神经性聋患者为研究对象(试验组)，分为A组(30～50岁)和B组(51～70岁)。A组467例，男236例，女性231例，平均年龄40.54±5.32，言语频率听阈26～120 dB HL,平均听阈50.91±19.34 dB HL；B组439例，男208例，女231例，平均年龄62.02±3.44岁，言语频率听阈26～120 dB HL，平均听阈53.53±18.44 dB HL。对照组分别为C组(30岁～50岁)和D组(51～70岁)。C组278例，男147例，女131例，平均年龄40.23±4.99，言语频率听阈-5～25 dB HL，平均听阈9.22±6.39 dB HL；D组477例，男257例，女220例，平均年龄61.08±4.31岁，言语频率听阈-5～25 dB HL，平均听阈11.33±6.25 dB HL。试验组与对照组间低年龄段与高年龄段组间分别进行年龄和性别匹配分析，经统计学检验二者均无显著差异，说明样本年龄及性别均衡可比。本研究经南京军区福州总医院伦理委员会论证同意，研究对象均同意参加研究并签署知情同意书。

1.2GRM7基因多态性分析 抽取每位研究对象静脉血液2 ml，EDTA2K抗凝管储存于-20 ℃冰柜备用。参考Friedman等[1]和Luo等[2]有关GRM7基因多态性与耳聋易感性的研究，选择rs11928865 和 rs11920109两个位点分析不同年龄段感音神经性聋患者及正常对照组成年人GRM7基因单核苷酸多态性。基因分型采用PCR扩增和Sequenom MassARRAY特定SNPs分析方法，基因组DNA提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，用标准提取方法从全血样品中提取；引物设计结合文献采用Assay Designer 3.1软件，由北京六合华大基因科技公司合成(5'-AGAGCTGACCAAGTAGGAC-3'and5'-GGGATGTTCTGACAGCCAG-3')；运用 Sequenom MassARRAY技术对选定的2个SNP 位点进行样本分型检测，PCR扩增在384孔板的 PCR仪上设定，PCR 反应条件为：94 ℃ 15分钟；94 ℃ 20秒，56 ℃ 30秒，72 ℃ 1分钟，45个循环；72 ℃ 3分钟；4 ℃保持。PCR分析后产物的测序由北京六合华大基因科技公司完成。

1.3统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析,应用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验各组基因频率的群体代表性；计量资料进行t检验，计数资料进行多层卡方检验或Fisher`s确切概率法检验，组间等位基因频率和基因型频率比较采用卡方检验，基因型的相对危险度以优势比(odds ratio，OR)及95%可信区间(95%CI)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

GRM7基因rs11928865、rs11920109位点基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡检验，说明本研究纳入的样本具有随机性和群体代表性。

由表1可见，GRM7 rs11928865位点基因型及等位基因频率在A组与C组间差异无统计学意义(P=0.937, OR=1.035, 95% CI=0.787～1.360；GRM7 rs11920109位点基因型及等位基因频率在A组与C组间差异无统计学意义(P=0.815, OR=1.052, 95% CI=0.815～1.300)。

表1 GRM7 rs11928865和rs11920109位点基因型分布及等位基因频率在A组与C组间比较(例，%)

由表2可见，GRM7 rs11928865位点基因型在B组与D组间差异有统计学意义(P=0.001, OR=1.463, 95% CI=1.136～1.884)；而GRM7 rs11920109位点基因型在B组与D组间差异无统计学意义(P=0.349, OR=0.864, 95% CI=0.712～1.047)。

表2 GRM7 rs11928865和rs11920109位点基因型分布及等位基因频率在B组与D组间比较(例，%)

Logistic分析提示rs11928865位点TT与AT在B组与D组间差异有统计学意义(P<0.001, OR=0.578, 95% CI=0.429～0.779)，TT与AA差异无统计学意义(P=0.260，OR=0.617，95% CI=0.266～1.429)(表3)。

表3 Logistic分析GRM7 rs11928865位点基因型在B组与D组间的比较(例)

3 讨论

感音神经性聋发病率与年龄密切相关，随着年龄增长其发病率逐渐增加;环境因素与遗传因素是感音神经性聋的两大病因，文献报道遗传因素占年龄相关性聋病因的35%～55%[3]。有研究发现部分基因异常，如：GJB2 基因突变[4]、GHRL2的移码突变[5]以及钙粘蛋白基因CDH23突变[6]等与年龄相关性感音神经性聋有关，但大多数成年感音神经性聋无典型家族遗传现象。

SNPs可能引起蛋白质表达的质或量的变化，这种变化可能与某些疾病发生或疾病易感性相关。Friedman等[1]对来自欧洲国家的年龄在53～67岁的感音神经性聋患者进行基因分析，发现耳聋组与对照组间存在GRM7基因单核苷酸多态性差异；Newman等[7]研究发现美国人群中GRM7基因与听觉感知和言语识别有显著关联性。经用Haploview software 4.2软件分析，GRM7基因SNPs rs11928865、rs9877154、rs6804466和rs3828472位于单倍体1上，SNPs rs9819783、 rs11920109位于单倍体2上。rs11928865 和 rs11920109 具有连锁不平衡(r2=0.173, D’=0.815, LOD=1.85), 因此，本研究选择rs11928865 和 rs11920109两个位点来分析GRM7基因单核苷酸多态与不同年龄段人群感音神经性聋的相关性。

虽然多篇文献报道GRM7基因SNPs与年龄相关性感音神经性聋易感性有关[1,2,7]，但文献中研究对象年龄、性别、种族、全身情况等均存在不同。Friedman等[1]的研究对象年龄是50岁以上且是欧洲群体，男女均有，其发现GRM7基因rs11928865等位基因和2个单倍体区(block6,7))在耳聋组和对照组间有显著差异，提示GRM7 rs11928865与该组病例耳聋易感性相关。Newman等[7]研究对象是平均年龄为71.3岁的美国老年人，其发现GRM7基因SNPs不仅与耳聋易感性有关，还与研究对象的语言分辨率有关。Luo[2]选取的是70～100岁年龄段的中国男性人群为研究对象，且研究对象患有全身性疾病时也纳入研究中，其发现rs11928865位点与中国老年男性双耳对称性感音神经性聋显著相关，并且不同听力下降类型者该基因多态性也存在差异。从文中结果看，51～70岁年龄段双耳对称性感音神经性聋组与同年龄段对照组GRM7基因rs11928865位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，认为GRM7基因rs11928865位点多态性与51～70岁年龄段组耳聋易感性相关；30～50岁年龄段耳聋组与对照组之间GRM7基因rs11928865位点基因型分布差异无统计学意义，认为GRM7基因rs11928865位点多态性与30～50岁年龄段耳聋易感性无相关性。

在临床工作中发现部分中年人也表现出与老年性聋同样特征的听力下降，即部分听力下降人群在全身其它器官还没有表现出老龄变化时就已经出现与老年性聋特征相同的双耳对称性感音神经性聋。

本研究结果显示GRM7基因rs11928865位点多态性与51～70岁年龄段组耳聋易感性相关，与30～50岁年龄段耳聋易感性无关，推测感音神经性听力损失发病年龄的差异可能与不同的遗传病因有关；另外，本研究没有发现rs11920109位点多态性与各耳聋组发病有相关性，这可能是由于感音神经性聋是多基因致病的复杂性疾病，且环境因素、某些药物、全身系统疾病及不良生活习惯等都有可能参与了这一过程。多基因疾病为多个微效基因共同致病,其不仅是多个微效基因易感性的联合,还可能包括它们之间网络性的相互作用,或者是两者兼有。目前已经有研究发现多个感音神经聋的微效致病候选基因,包括GJB2基因[4,8，9]、GRHL2基因[5]、CDH23基因[6]、KCNQ4基因[10]、NAT基因[11～13]、APOE基因[14]、UCP2基因[15，16]等，很有可能它们是两者、三者、抑或是更多相互作用而致病；进一步研究可能会发现有其它基因多态性与耳聋易感性有关。