白藜芦醇对糖尿病大鼠内耳损伤的保护作用及机制研究△

高海涛 曲雁 张勋 穆俊晌 张璞 王欣 赵秀棉

听力损伤为糖尿病常见并发症之一，糖尿病引起的耳蜗微血管病变和神经病变，可影响耳蜗毛细胞功能及听神经信号传导功能，是造成听力损失的重要原因[1, 2]。研究表明白藜芦醇具有舒张血管、改善血管内皮功能、抑制血管炎症反应、抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、抗血管内皮细胞凋亡的作用[3～5]。白藜芦醇可通过降低血糖、血脂水平和抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)高表达而改善糖尿病视网膜血管的结构和功能异常[6]；白藜芦醇还可抑制高糖环境下的视网膜血管内皮细胞增殖[7]；而在高糖环境下，白藜芦醇是否能减轻内耳微血管损伤尚不清楚。本研究拟探讨白藜芦醇对糖尿病大鼠内耳损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 2月龄的健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，体重250～300 g，购自河北医科大学实验动物中心。不限食水，在12 h光照周期、温度22～25 ℃、湿度65%的环境中饲养。将大鼠随机分为白藜芦醇高、低剂量治疗组，模型组及正常对照组，每组15只。

1.2糖尿病大鼠模型的建立 除正常对照组外，各组大鼠禁食24 h，以360 mg/kg的剂量给予所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，高、低剂量治疗组及模型组大鼠以40 mg/kg的剂量经股静脉单次注射链脲佐菌素(STZ)溶液建模，同时给予高脂饲料(北京博奥饲料公司)喂养；对照组注射等量生理盐水。高、低剂量治疗组及模型组大鼠注药后3 d检测空腹血糖，以空腹血糖≥11 mmol/L为糖尿病模型建立成功。

1.3白藜芦醇给药剂量及方法 高、低剂量治疗组每天分别以100、50 mg/kg的白藜芦醇(美国Sigma公司)灌胃1次，对照组及模型组每天以等量的生理盐水灌胃一次。各组均正常摄食、摄水，持续治疗4个月。实验操作遵循《实验动物学》[8]有关规定，实验设计及实施均经过本院动物伦理委员会审核批准。

1.4听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测 4个月的治疗结束后随机选取各组大鼠6只，水合氯醛麻醉，隔音屏蔽室内检测ABR阈值，记录电极置于颅顶正中，参考电极和接地电极分别置于给声耳及对侧耳后的乳突部皮下，耳机放置在距外耳道 0.5 cm处。具体操作与设置参考刘宏伟等[9]使用的方法。

1.5血管通透性评价 完成ABR检测后随机选取各组大鼠4只，沿股静脉注射0.02 mg/ml伊凡思蓝(EB)0.2 ml，60 min后，沿心脏灌注0.9%生理盐水200 ml，5 min内灌注完毕。分离耳蜗，经甲酰胺(1∶4)匀浆组织，匀浆的耳蜗组织在60 ℃下放置24 h，70 000 g离心45 min；检测波长620 nm处的吸光度值，以此表示提取物中EB含量，以100 mg湿重的耳蜗组织中所含的EB含量表示内耳血管通透性，EB含量越高，血管通透性越好。

1.6大鼠血糖、血脂及内耳组织氧化应激指标检测 治疗结束后随机选取各组大鼠4只，经股静脉采血2 ml，4 ℃，3 000 g离心10 min分离血浆备用；用酶-底物试剂盒(上海生物工程公司)检测各组大鼠空腹血糖、血浆胆固醇及血浆甘油三酯水平(所有操作均按试剂盒说明书进行)。采血后处死大鼠，分离耳蜗，充分匀浆，在60 ℃下放置24 h，70 000 g离心45 min后备用；丙二醛、过氧化氢、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶测试盒均购于南京建成生物工程研究所，严格根据说明书步骤进行操作，检测耳蜗组织中的丙二醛、过氧化氢、超氧化物歧化酶及过氧化氢酶含量。

1.7免疫组化检测内耳组织VEGF及细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)表达 治疗结束后随机选取各组大鼠3只，分离耳蜗组织后，脱钙、脱水、石蜡包埋、超薄切片(厚度为4 μm)、脱蜡、入水冲洗，切片上依次滴加抗原修复液、山羊血清封闭液、一抗、生物素化二抗、辣根酶标记链霉卵白素工作液，辅以0.1 MPBS冲洗，DAB显色，水洗，苏木素复染，再水洗、1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝、水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明两次、中性树脂封片;显微镜下观察VEGF、ICAM-1表达。

1.8Western blot检测内耳组织凋亡促进因子caspase-3、Bax和凋亡抑制因子Bcl-2、VEGF、ICAM-1蛋白表达 治疗结束后，选取各组大鼠4只，分离耳蜗组织，充分裂解，BCA法检测各样品蛋白浓度；凝胶电泳后转膜，电化学发光液曝光，采用Image J软件进行灰度值分析；以目的蛋白与内参tubulin的灰度值比值表示目的蛋白表达量，并以正常对照组作为对照检测各组大鼠耳蜗组织中caspase-3、Bax、Bcl-2、VEGF、ICAM-1蛋白表达。caspase-3、Bax、Bcl-2抗体购自美国Abcam公司；VEGF、ICAM-1购自美国CST公司；BCA蛋白定量测定试剂盒、ECL发光液购自美国ThermoFisher Scientific公司。

1.9统计学方法 相关数据运用SPSS 17.0统计软件，计量资料，计量资料组间比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠ABR检测结果及内耳血管通透性比较 模型组大鼠ABR阈值(63.56±4.11 dB SPL)显著高于对照组(24.38±3.07 dB SPL) (P<0.05)，与模型组比较，低、高剂量治疗组大鼠ABR阈值(分别为45.34±3.81、43.62±4.75 dB SPL)均显著下降。模型组内耳EB含量(4.6±0.8 ng)显著高于对照组(1.5±0.4 ng) (P<0.05)，与模型组比较，低、高剂量治疗组内耳EB含量均明显降低(分别为2.3±0.7 ng，2.1±0.6 ng)。

2.2各组大鼠血糖、血脂及内耳组织氧化应激水平(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛及过氧化氢含量)比较 与对照组比较，模型组大鼠的空腹血糖、血浆总胆固醇及血浆甘油三酯水平均显著升高(均为P<0.05)；白藜芦醇干预后，高、低剂量治疗组大鼠的空腹血糖、血浆总胆固醇及血浆甘油三酯水平均明显低于模型组(均为P<0.05) (表1)。

与对照组比较，模型组大鼠内耳组织的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平明显降低(均P<0.05)，丙二醛和过氧化氢水平则明显上升(均P<0.05)；白藜芦醇干预后，高、低剂量治疗组大鼠内耳组织的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平均显著高于模型组(均P<0.05)，丙二醛和过氧化氢水平则显著低于模型组(均P<0.05) (表1)。

表1 各组大鼠血糖、血脂及内耳组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛及过氧化氢含量比较±s)

注：#与对照组比较，P<0.05；*与模型组比较，P<0.05；△与低剂量治疗组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠内耳组织VEGF、ICAM-1蛋白表达比较 各组内耳组织中VEGF、ICAM-1蛋白阳性表达均呈棕黄色颗粒状，主要分布在耳蜗螺旋神经节细胞质中，见图1。与对照组比较，模型组大鼠耳蜗组织的VEGF、ICAM-1蛋白表达水平显著升高(均为P<0.05)；白藜芦醇干预后，高、低剂量治疗组的VEGF、ICAM-1蛋白表达水平与模型组比较均显著降低(均为P<0.05) (图2，表2)。

2.4各组内耳组织凋亡促进因子caspase-3、Bax和凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达 与对照组比较，模型组大鼠耳蜗组织的caspase-3、Bax蛋白表达显著上调(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；白藜芦醇干预后，高、低剂量治疗组的caspase-3、Bax蛋白表达水平与模型组比较均显著下调(均为P<0.05)，Bcl-2表达则显著升高(P<0.05) (图3，表3)。

3 讨论

糖尿病对听觉系统的影响可引起渐进性双侧对称性感音神经性聋，患者可出现耳蜗、神经传导通路甚至是脑干异常，听力损失机制涉及微血管病变、神经病变等[10, 11]。糖尿病微血管病变表现为耳蜗血管基底膜增厚、血管内皮细胞增生、透明变性等[11]。另外，长期高血糖可使神经系统产生病理生理变化，导致神经内膜低氧、氧化应激及神经营养减少[2]。本研究结果显示模型组及高、低剂量白藜芦醇治疗组大鼠ABR反应阈均较对照组明显升高，提示糖尿病大鼠听功能受到损伤；且模型组内耳血管通透性较对照组增强，内耳组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶较对照组明显降低，丙二醛、过氧化氢较对照组明显升高，提示糖尿病大鼠内耳组织氧化应激水平升高。

研究表明，白藜芦醇可改善高脂饮食诱发的代谢性疾病症状[12]，还可改善糖尿病血管病变，抗氧化应激、减少低密度脂蛋白氧化[13]；但未见白藜芦醇在糖尿病内耳损伤发生中的作用的研究。从本研究结果看，高、低剂量治疗组大鼠内耳EB含量明显低于模型组，ABR反应阈明显低于模型组，提示白藜芦醇可抑制高糖环境诱导的听力损伤及减弱内耳血管通透性，机制可能与其降低血糖、血脂水平及抑制氧化应激和血管通透因子VEGF有关；白藜芦醇可减轻糖尿病缺血缺氧诱发的氧化应激和炎症损伤[14]，为本研究结果提供支持；另外，文中结果显示高、低剂量白藜芦醇对糖尿病大鼠内耳损伤的保护作用没有显著差异。

图1 各组大鼠耳蜗组织螺旋神经节VEGF和ICAM-1表达(免疫组化×200)

图2 Western blot检测各组大鼠耳蜗组织VEGF和ICAM-1表达

表2 各组大鼠耳蜗组织VEGF、ICAM-1蛋白相对表达水平±s)

注：#与对照组比较，P<0.05；*与模型组比较，P<0.05。

图3 Western blot检测大鼠耳蜗组织caspase-3, Bax及Bcl-2表达

表3 大鼠耳蜗组织caspase-3, Bax及Bcl-2蛋白相对表达水平±s)

注：#与对照组比较，P<0.05；*与模型组比较，P<0.05。

VEGF又称血管通透因子，能刺激血管内皮细胞有丝分裂，促进内皮细胞迁移、增殖，增加血管通透性，改变细胞外基质，还可促进黏附分子如ICAM-1表达[15]。ICAM-1是在细胞表面表达的介导细胞间或细胞与细胞外基质相互作用的糖蛋白，在机体炎症与免疫应答，伤口修复，凝血与血栓形成等病理过程中扮演重要角色[16]。文献报道白藜芦醇能通过下调VEGF表达减轻低压低氧诱发的急性脑水肿[17]，其衍生物还可抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞ICAM-1表达[18]。本研究结果显示，使用高、低剂量白藜芦醇治疗后，高、低剂量治疗组大鼠内耳组织中VEGF、ICAM-1蛋白表达水平明显低于模型组，且两治疗组的ABR反应阈也明显低于模型组，说明白藜芦醇可能通过抑制糖尿病大鼠耳蜗组织VEGF、ICAM-1的表达，缓解听功能损伤。

文献报道2型糖尿病患者和糖尿病动物模型均表现为耳蜗血管纹基底膜明显增厚，耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹内皮细胞明显缺失[19, 20]。研究表明白藜芦醇可抑制PM2.5诱导的血管内皮细胞凋亡[21]，还可通过抑制细胞凋亡延缓内皮细胞自然衰老[22]。本研究检测了糖尿病模型大鼠耳蜗组织凋亡促进因子caspase-3、Bax及凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达，结果显示，糖尿病大鼠耳蜗组织caspase-3、Bax表达增多，Bcl-2表达减少，且应用白藜芦醇干预后两治疗组内耳的caspase-3，Bax表达较模型组明显下调(P<0.05)，Bcl-2表达明显升高(P<0.05)，提示白藜芦醇可通过下调内耳的caspase-3、Bax表达、上调Bcl-2表达发挥对糖尿病大鼠内耳损伤的保护作用。

综述所述，白藜芦醇可减弱糖尿病大鼠内耳血管通透性，对内耳损伤具有一定的保护作用，机制可能与其降血糖血脂、抗氧化应激、减少VEGF和ICAM-1表达、抑制细胞凋亡有关。