虾青素对急性心梗大鼠心肌细胞凋亡及caspase-3表达的影响

沈 成,王 龙*,康 文,潘 侠,王 晞

(1武汉大学人民医院麻醉科,武汉 430060;2武汉大学心血管病研究所;*通讯作者,E-mail:wanglongwhu@163.com)

急性心肌梗死是心血管疾病中致死率最高的疾病[1]。目前,已有多种手段可以恢复心梗早期缺血再灌注降低心肌缺血造成的心肌损伤,但仍有部分患者难以避免地出现心肌坏死,导致致死性心律失常,心力衰竭的发生。因此,寻找心肌保护的途径很有必要。

虾青素(astaxanthin,AST)是一种广泛存在于微生物和海洋生物中的类胡萝卜素。已有研究表明,虾青素能通过抗氧化应激及抑制炎症反应,增强心肌收缩指数和心肌细胞线粒体膜电位以保护受损心肌[2,3]。胱天蛋白酶-3(caspase-3)是半胱氨酸蛋白酶的家族成员之一,急性心肌梗死早期caspase-3受到体内外各种因素刺激发生活化,而caspase-3的活化是心肌细胞凋亡进入不可逆转阶段的关键步骤[4]。鉴于caspase-3在细胞凋亡中的特殊作用,且虾青素在心梗大鼠的心肌保护作用是否与抑制caspase-3的活化相关未见具体报道。本研究通过建立大鼠急性心肌梗死模型,探讨虾青素对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡以及caspase-3活化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

虾青素(SML0982-501,Sigma),TUNEL试剂盒(11684817910,Roche公司),SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(AS1012,ASPEN),RIPA总蛋白裂解液(AS1004,ASPEN),BCA蛋白质浓度测定试剂盒(AS1086,ASPEN),ECL化学发光检测试剂盒(AS1059,ASPEN),Cleaved Caspase-3一抗(ab49822,abcam)。呼吸机(TKR 400H,特力),电生理记录仪(MP150,BIOPAC),倒置显微镜(IX51,OLYMPUS),奥林巴斯显微镜成像系统(MicroPublisher,Q-IMAGING)。

1.2 实验动物与分组

6-8周龄雄性SD大鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2011-0003)25只,清洁级,体质量200-250 g。以一般饲料适应性饲养1周,将大鼠随机分为3组:假手术组(n=5)、心梗组(n=10)、虾青素组(n=10)。将虾青素溶解于生理盐水中,虾青素组从心梗模型建立的第1天开始以5 mg/(kg·d)(SML0982-501,sigma)的虾青素混悬液连续3 d(1次/d)灌胃大鼠,心梗组和假手术组给予等量生理盐水。

1.3 大鼠心梗模型的建立

造模前大鼠禁食12 h,禁水4 h。腹腔注射3%戊巴比妥钠(30-40 mg/kg)麻醉,颈部及胸前剃毛,局部常规消毒。将四肢及门齿固定于操作台上,四肢用针刺电极连接MP-150电生理记录仪行术中心电监测。在甲状软骨水平将颈部皮肤剪开一长约1 cm切口,暴露气管,插入自制气管导管。注意气管导管不要插入太深以防单肺通气,插入角度不要太陡以防扎穿气管,误入食管。接通小动物呼吸机行控制性机械辅助通气,呼吸机设置参数:呼吸频率70次/min,吸呼比1 ∶1.5,潮气量3.0 ml/kg。观察气道压力以及呼吸动度,保证大鼠呼吸回路通畅。在大鼠胸骨左缘约0.5 cm处纵行剪开皮肤,切口长约3.0 cm,钝性分离胸大肌,显露助骨。断开第3-4肋后用开睑器撑开肋骨以显露心脏。撕开心包膜,在左心耳下方约2 mm处以6/0缝线结扎冠状动脉前降支。结扎点以下心肌由红变白、心尖搏动减弱、MP-150心电监护示ST段抬高时确认心肌梗死模型制作成功。清理胸腔后逐层缝合胸壁肌肉关胸。待大鼠自主呼吸恢复且呼吸规律后撤离呼吸机,保暖直至麻醉苏醒,术后常规饲养。假手术组在开胸后仅在冠状动脉下穿线而不结扎,其余步骤同上。

1.4 HE染色检测心梗后心肌组织大体形态变化

心梗第3天处死大鼠后剪取心脏。用4 ℃生理盐水反复冲洗心脏,除去右心室、左右心房以及大血管等多余组织。在结扎点处垂直于左心室长轴方向将左心室一分为二。将结扎点以下心肌用4%多聚甲醛溶液固定24 h,然后常规脱水、石蜡包埋,制备厚度4 μm的组织切片。

1.5 TUNEL法检测心梗组织细胞凋亡

采用TUNEL法常规处理各组左心室石蜡标本,实验步骤按照TUNEL试剂盒执行。在每组5个200倍视野下统计凋亡细胞数和总细胞数。正常心肌细胞呈蓝色,凋亡心肌细胞胞核为荧光绿色。凋亡指数(AI):AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.6 Western Blot法检测心脏梗死周边区的活化的caspase-3含量

取材时,将靠近结扎点附近的心肌组织通过肉眼区分心肌梗死区以及梗死周边区,剪下梗死周边区心肌组织后,立即存入-80 ℃冰箱。用Western blot法检测心脏梗死周边区活化的caspase-3的表达。大鼠心肌梗死后的心脏通过肉眼观察主要表现为结扎点以下梗死心肌变白、变薄,形成梗死瘢痕。变白、变薄区域称为梗死区。梗死周边区主要界定为梗死瘢痕外约1 mm以内区域。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色结果

HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞包膜完整,心肌纤维走行整齐,无炎性细胞浸润,心肌组织未见明显病理改变。心梗组大鼠心肌细胞包膜不完整,排列紊乱,心肌组织细胞浆着色变深,心肌纤维断裂伴有大量炎性细胞浸润。与心梗组相比,虾青素组大鼠心肌细胞变性程度以及炎性细胞浸润程度均有所减轻,可见断裂的心肌纤维(见图1)。

A.假手术组;B.心梗组;C.虾青素组(心肌纤维呈红色,细胞核呈蓝色)图1 心肌梗死第3天心脏组织HE染色 (×40)Figure 1 HE staining of heart tissue at day 3 after myocardial infarction (×40)

2.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数结果

TUNEL检测结果显示:假手术组心肌细胞凋亡指数为(1.17±0.6)%,心梗组大鼠心肌梗死周边区心肌细胞凋亡指数为(69.53±14.87)%,虾青素组心肌梗死周边区心肌细胞凋亡指数为(11.98±5.58)%。与假手术组比较,心梗组大鼠心肌梗死周边区凋亡指数显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。与心梗组比较,虾青素组大鼠心肌梗死周边区心肌细胞凋亡指数降低(见图2),差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。表明虾青素可降低大鼠心肌梗死后梗死周边区心肌细胞凋亡水平。

图2 心肌梗死第3天TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 (×200)Figure 2 Myocardial cell apoptosis detected by TUNEL staining on the third day after myocardial infarction (×200)

2.3 心脏梗死周边区活化的caspase-3蛋白表达及半定量分析

Western blot法检测显示:假手术组心脏梗死周边区活化的caspase-3灰度值为0.09±0.02,心梗组心脏梗死周边区活化的caspase-3灰度值为0.70±0.06;虾青素组心脏梗死周边区活化的caspase-3灰度值为0.29±0.09。与假手术组相比,心梗组大鼠心脏梗死周边区活化的caspase-3含量显著增加(P<0.05,见图3);与心梗组比较,虾青素组大鼠心肌梗死周边区活化的caspase-3含量减少,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3)。

图3 心肌组织梗死周边区活化的caspase-3含量(n=5)Figure 3 The content of cleaved caspase-3 in the surrounding area of myocardial infarction(n=5)

3 讨论

天然虾青素是从海洋微生物雨生红球藻中获得的一种脂溶性类胡萝卜素。虾青素分子结构两端存在关键性的α-羟基酮结构提高了其对抗氧化应激损伤的效率,并使其与自由基反应的终产物更加稳定。研究发现,虾青素清除氧自由基及防止脂质自氧化的效力是维生素C的6 000倍,辅酶Q10的800倍,维生素E的550倍[5,6]。现已有关于虾青素在心血管疾病治疗方面的相关研究。Kumar等[7]研究发现,虾青素能通过降低高脂血症大鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、2-巯基苯甲酸水平,以及增加高密度脂蛋白胆固醇含量来改善高脂血症大鼠的动脉粥样硬化状态。研究人员发现,虾青素通过部分激活沉默调节蛋白1(sirtuin type1,SIRT1)信号通路以及抑制R-SMADs的乙酰化减轻由于心脏压力负荷过重引起的小鼠心脏功能障碍和心肌纤维化[8]。Gross等[9]在大鼠心脏缺血/再灌注模型中观察到,连续服用虾青素可明显缩小实验组大鼠心肌梗死面积,增加心肌存活率以及降低血浆中脂肪酸氧化产物的含量。我国学者在犬心肌梗死模型中发现,虾青素能够上调Nrf2的表达,增加实验组犬血清中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力,从而增强其抗氧化能力并降低氧化产物的产生,保护心肌细胞[10]。另有研究表明,虾青素能激活Wnt/β连环蛋白信号通路来抑制细胞凋亡以及诱导血管生成[11]。

心肌细胞凋亡是各种心血管疾病走向终末阶段的细胞分子基础。在心肌细胞凋亡过程中,处于凋亡级联反应下游的caspase-3的活化是细胞凋亡过程中最为关键的一步。而在急性心肌梗死后,caspase-3的激活由于神经内分泌系统激活后产生的内源性过氧化物触发[4]。据此可以合理推测,抑制过氧化物的产生可以减少caspase-3活化。本实验结合已有关于虾青素的抗氧化应激能力在心血管疾病方面的保护作用,以及活化后的caspase-3在心梗后心肌细胞凋亡方面的作用的基础上进一步进行假设后进行实验设计。

本研究通过结扎大鼠左前降支冠状动脉制备急性心肌梗死模型观察到:急性心肌梗死大鼠食量减少,活动耐量减低,部分大鼠出现口唇及四肢皮肤发绀现象。HE染色可见急性心梗大鼠心肌纤维断裂,心肌细胞出现变性、坏死,心肌组织中有大量炎性细胞浸润。心脏梗死周边区凋亡细胞数目以及活化的caspase-3含量均较假手术组增高。灌胃给予虾青素后,虾青素组大鼠心肌细胞变性程度与炎性细胞浸润程度均减轻,心肌梗死周边区心肌细胞凋亡程度和活化的caspase-3含量表达降低。本次实验结果表明虾青素可以抑制caspase-3的激活,降低心肌细胞凋亡程度,从而尽可能地挽救存活心肌,减少心肌梗死面积,保护心梗大鼠的心肌细胞。

在1999年美国食品和药物管理局批准虾青素作为膳食补充剂[12]。2003年,Spiller等[13]在关于虾青素的安全性评估实验中发现,口服虾青素未对健康人血压以及其余各项生化指标产生影响。2008年,Miyawaki等[14]研究表明口服虾青素不会对长期使用阿司匹林的患者血小板凝聚功能和纤维蛋白溶解功能产生不良影响。虾青素的高生物安全利用度以及抗氧化应激能力在心血管方面的研究让科研人员看到了虾青素良好的开发价值。虾青素的其他生物学应用也值得广大科研人员去探索。