结直肠腺癌组织中长链非编码RNA linc00511表达变化及意义

刘鑫，武雪亮，薛军

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

全球每年结肠直肠癌死亡患者超过50万人[1]，远处转移是其主要死因。长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，不具有蛋白质编码潜力。最近研究表明，lncRNA在不同的生物过程中起关键作用，包括选择性剪接、基因印迹、核内运输、细胞分化和RNA衰变等[2,3]。有研究表明，lncRNA SOX21-AS1在结直肠癌组织中高表达，并且是导致患者预后不良的原因之一，并通过募集和结合miR-145-MYO6促进肿瘤生长[4]；lncRNA ZFAS1通过结合miR-484促进结直肠癌的肿瘤生长和浸润转移[5]；另一个重要的lncRNA HOTAIR可以调控多梳蛋白依赖性染色质修饰，并且与结直肠癌预后不良有关[6]。据文献报道，linc00511在小细胞肺癌组织中高表达，并且通过结合EZH2抑制p57进而促进小细胞肺癌的侵袭迁移[7]。然而，linc00511在结肠癌组织中的表达水平及其功能尚未研究。因此，本研采用实时定量PCR法检测linc00511在结直肠腺癌组织中的表达情况，并分析其与临床病理参数及预后的关系，为结直肠腺癌的早期诊断及靶基因治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取河北北方学院附属第一医院2011年1月～2012年1月确诊的50例结直肠腺癌患者的癌组织及其对应癌旁组织标本。患者中男27例，女23例；年龄30～83岁，其中≤55岁19例、>55岁31例；肿瘤直径<5 cm 27例，≥5 cm 23例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期26例；组织分化程度高分化21例、中低分化29例；淋巴结转移21例，无淋巴结转移29例；远处转移12例，无远处转移38例。术后随访至2017年2月20日，死亡28例。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者术前均未接受除手术外的其他治疗，均签署知情同意书。

1.2 结直肠腺癌及癌旁组织中linc00511检测方法 采用实时定量PCR法。提取组织中的总RNA，加入500 μL TRIzol试剂裂解，收集到1.5 mL无酶EP管。加入100 μL氯仿，室温静置3 min，12 000 r/min离心15 min；将200 μL上层液体移入新的1.5 mL EP管中，加入250 μL异丙醇，混匀，静置10 min；12 000 r/min离心10 min，弃上清液，以 75%乙醇溶液(含DEPC)洗涤沉淀3次(7 500 r/min离心5 min)；待RNA沉淀基本透明时，加入ddH2O至充分溶解，测定RNA的质量及浓度。按照Takara RR036A试剂盒说明书逆转录合成cDNA，以使用CFX96实时PCR检测系统测定linc00511。linc00511上游引物5′-TCTCCTTGTGCAAACCTCC-3′，下游引物5′-CCCACATTGAGCGAATGCC-3′；内参GAPDH上游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATT-TC-3′，下游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′。反应体系(10 μL)：2×iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix 5 μL，上、下游引物(0.4 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，RNase Free H2O 3.8 μL。反应条件：预变性95 ℃，30 s；变性95 ℃，5 s，退火/延伸60 ℃，30 s，共40个循环，65～95 ℃熔解曲线分析。每次3个复孔，重复3次。目的基因的表达应用2-ΔΔCt法进行相对定量，中位数以上为高表达，中位数以下为低表达。

2 结果

2.1 结直肠腺癌及癌旁组织中linc00511表达比较 结直肠腺癌组织中linc00511表达量为3.20±1.29，高于癌旁组织中的1.21±0.92(P<0.01)。

2.2 linc00511表达与结直肠腺癌患者临床病理参数的关系 淋巴结转移和远处转移的结直肠腺癌组织中linc00511高表达者高于无淋巴转移、无远处转移者(P均<0.05)，而不同性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度、TNM分期间差异无统计学意义。见表1。

表1 linc00511表达与结直肠腺癌患者临床病理参数的关系(例)

2.3 linc00511表达与结直肠腺癌患者预后的关系 linc00511高表达和低表达者的5年生存率分别为40%(10/25)、72%(18/25)，linc00511高表达者5年生存率低于低表达者(P<0.05)。

3 讨论

结直肠癌是一种常见的消化道肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一[8～10]。约20%的结直肠癌患者在诊断时已经转移[11]，在晚期结直肠癌患者中更常见，通常传播到肝脏和肺。事实上，转移是结直肠癌患者癌症相关死亡的主要原因之一[12,13]。研究结直肠癌的进展和转移的分子机制，可为临床寻找更好的结直肠癌治疗新靶点。

结直肠癌的发生发展是一个多阶段、多影响因素的复杂过程。很多学者对其发生机制进行了研究,近来lncRNA吸引了世界范围内研究人员的巨大兴趣。许多lncRNA在人类肿瘤发生中异常表达并充当调节剂，已报道多种lncRNA在结直肠癌发生中起重要作用。例如：H19通过结合eIF4A3促进结直肠癌的发生发展[14]；RP4通过发挥海绵作用吸附miR-7-5p促进结肠癌进展[15]；GAPLINC通过miR-34a/c-MET信号通路调节结肠癌细胞的侵袭和迁移能力[16]。

近期研究发现，linc00511可通过结合EZH2抑制p57，进而促进小细胞肺癌的侵袭迁移[7]。本研究发现，结直肠腺癌组织中linc00511表达量高于正常结直肠组织，与Sun等[7]研究结果相似，提示linc00511在结直肠癌中可能充当一个促癌基因的作用。本研究将linc00511在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平从低到高排序，中位数以上为高表达、以下为低表达，分析linc00511与结直肠癌患者临床病理特征与预后的关系。结果发现，有淋巴结转移和远处转移者linc00511高表达比例高于无转移者，而不同性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度和TNM分期间差异无统计学意义。这提示linc00511可能是促进结直肠癌发生转移的重要原因之一，有望成为预测结直肠癌患者是否有转移的因子之一。本研究还发现，linc00511高表达者的5年生存率低于低表达者。这提示linc00511的高表达是结肠癌患者的预后危险因素，可作为判断结直肠癌预后的指标之一，是潜在的治疗靶点。

综上所述，本研究结果提示linc00511在结直肠癌发生发展中起重要作用，尤其在判断结直肠癌患者转移和预后中具有潜在的应用价值，为我们在结直肠癌患者的治疗提供了新的思路，为结直肠癌的靶向治疗提供了理论基础。