PI3K/Akt通路在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用

曹煜姗，孙达权，夏庆，彭明兵，徐国强

(贵州医科大学，贵阳550025)

原发性肝癌(HCC)是一种恶性程度高、进展快、预后差的恶性肿瘤[1]。肝癌的术后复发与转移是患者不能长期生存的主要原因。分子靶向药物治疗在控制HCC的肿瘤增殖、延缓复发转移以及提高患者的生活质量等方面具有独特的优势[2]。已知肝癌的发病机制中存在着多个关键性环节，是进行分子靶向治疗的理论基础和重要的潜在靶点[3]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号转导通路具有调控细胞增殖与凋亡的作用，与肝癌的发生、发展密切相关[4]。3-磷酸肌醇-依赖性激酶1(PDK1)、10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN)、Akt是PI3K/Akt信号通路的重要基因。Akt是PI3K/Akt信号通路中的原癌基因[5]，PDK1是PI3K/Akt途径中重要的信号分子，PDK1是Akt的上游基因，PDK1可以通过PI3K/Akt信号通路，调节细胞的一系列生物学反应，而活化的Akt可以调节其下游的多条路径，从而促进细胞增殖、生长、抗凋亡以及迁移[6]。PTEN是一种抑癌基因，可以直接抑制Akt的活性。2016年6月～2018年1月，我们以肝癌细胞为研究对象，通过加入化学抑制剂和激动剂的方式，抑制或促进PI3K/Akt通路相关蛋白表达，探讨PDK1、PTEN、Akt基因在肝癌细胞迁移、侵袭中的作用，为肝癌的靶向治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，RPMI-1640培养基购自HyClone公司，新生牛血清(FBS)购于四季青公司，二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司，PVDF膜购自Millipore公司，Transwell小室购自Corning公司，兔抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Akt抗体购自Cell Signaling Technology公司(1∶1 000稀释)，PTEN抗体购于Abcam公司(1∶500稀释)，Phospho-Akt、Phospho-PTEN、PDK1(Phospho-Tyr376)抗体购自Affinity公司，GAPDH抗体系单克隆抗体购自Proteintech公司，Akt特异性激动剂SC79、PTEN特异性抑制剂VO-OHpic、PDK1特异性抑制剂OSU03012购于MCE公司。

1.2 细胞培养与分组处理 将SMMC-7721细胞加入RPMI-1640培养基+15% FBS+1%青链霉素，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞培养至融合80%左右，用于后续实验。将细胞分为对照组、HSC-CM组、PDK1抑制剂组、Akt激动剂组、PTEN抑制剂组。对照组加入RPMI-1640培养基，HSC-CM组加入HSC-CM，PDK1抑制剂组加入OSU03012(终浓度0.3 μmol/L)，Akt激动剂组加入SC79(终浓度0.02 μmol/L)，PTEN抑制剂组加入VO-Ohpic(终浓度0.33 μmol/L)，各组细胞培养24 h后收集。

1.3 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。取各组细胞消化计数，按2×106/孔铺到6孔板中，每组设3个复孔。12 h后细胞完全长满，用不含血清的RPMI-1640培养基饥饿细胞12 h。使用20 μL的加样枪头，沿6孔板的刻度井字划痕。PBS洗去悬浮的细胞，加入新鲜的含1%血清的培养基常规培养。分别于0、72 h显微镜下拍照，观察各组细胞的迁移情况并测量划痕的宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-72 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.4 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。以1∶36的比例用RPMI-1640稀释Matrigel胶，取100 μL加入小室上室，置于细胞培养箱中孵育3 h。取各组细胞，加入胰蛋白酶消化，制成细胞密度为1×106/mL的细胞悬液，取200 μL接种于小室上层。下室加入含15% FBS的RPMI-1640培养液，常规培养24 h。取出小室，甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min。双蒸水冲洗，用棉签去除上室表面细胞，待膜干后在倒置显微镜下观察。每组细胞随机计数5个视野，统计穿膜细胞数，实验重复3次取平均值。

1.5 PDK1基因相关蛋白PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin及PTEN、Akt蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上孵育10 min，充分裂解细胞提取总蛋白，采用BCA试剂盒对细胞总蛋白进行定量。SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，以TBST缓冲液洗膜3次；加入一抗稀释液室温杂交3 h或4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜3次，加入相应的带有HRP发光基团的二抗室温孵育2 h。使用蛋白质印迹法分析蛋白表达。

2 结果

2.1 各组细胞迁移能力比较 对照组、PDK1抑制剂组、Akt激动剂组、PTEN抑制剂组的细胞迁移率分别为40.9%±9.28%、38.33%±8.54%、61.48%±4.89%、51.36%±4.7%。与对照组比较，PDK1抑制剂组细胞迁移率减少，Akt激动剂组细胞迁移率增加，PTEN抑制剂组细胞迁移率增加(P<0.05或<0.01)。

2.2 各组细胞侵袭能力比较 对照组、PDK1抑制剂组、Akt激动剂组、PTEN抑制剂组的穿膜细胞数分别为(12±1)、(8±2)、(46±3)、(31±1)个。与对照组比较，PDK1抑制剂组穿膜细胞数减少，Akt激动剂组穿膜细胞数增加，PTEN抑制剂组穿膜细胞数增加(P均<0.01)。

2.3 各组PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin及PTEN、Akt蛋白表达水平比较 见表1。与对照组比较，PDK1抑制剂组PDK1、p-PDK1表达降低，E-cadherin表达升高，Vimentin表达降低；Akt激动剂组Akt表达升高，PTEN表达降低；PTEN抑制剂组Akt表达升高，PTEN表达降低(P<0.05或<0.01)。

表1 各组PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin、PTEN、Akt表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

HCC是肝癌最常见的类型，在所有肝癌中占80%。HCC术后转移和复发的比例非常高，导致肝癌患者总体临床预后较差。化疗栓塞术可改善不能手术切除的HCC患者的生存率，然而许多患者合并晚期并发症，5年存活率仅5%[7]，因此急需寻找更有效的治疗方法。分子靶向治疗作为一种新型治疗肿瘤的方式，主要是针对肝癌发生微环境中特殊的分子异常，作用于肝癌发生和发展中起关键作用的靶分子和其调控的信号转导通路，为肝癌的治疗开辟了新局面。目前针对肝癌的分子靶向药物如索拉非尼、Brivanib已经应用于临床，但是缺乏特异性较高的肝癌分子靶向药物，目前大部分靶向肝癌相关信号通路的治疗药物存在有效率低、价格高昂、靶点选择性不高、高耐药性的缺点，疗效不甚理想。在肝癌治疗方面，目前有深入研究的几种经典的信号转导通路包括Wnt/β-catenin信号通路、Hedgehog信号通路，对于PI3K/Akt信号通路和肝癌的关系国内外报道较少。

研究显示，PI3K/Akt信号通路失调见于多种人类疾病，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经疾病[8]，人类肿瘤中PTEN常发生突变或缺失。Akt是PI3K/Akt信号通路中的原癌基因[9]，PDK1是PI3K/Akt途径中重要的信号分子，PDK1是Akt的上游基因，对Akt和其他PI3K/Akt下游激酶的活性进行调节，也就是说，PDK1可以通过PI3K/Akt信号通路，调节细胞的一系列生物学反应，而活化的Akt可以调节其下游的多条路径，从而促进细胞增殖、生长、抗凋亡以及迁移[10]。PTEN是一种抑癌基因，可以通过去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇抑制Akt活性。而激活PI3K/Akt信号通路之后，可以引起一系列的反应，包括促进细胞的生长、增殖，上皮间质转化(EMT)以及血管的生成[11]。蛋白质磷酸化/去磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最重要的、最普遍的形式，在信号转导的研究中有重要意义[12，13]。EMT是极化上皮细胞经历多种生化改变以呈现间充质表型的过程[14]。在恶性肿瘤进展过程中，上皮细胞常常失去其高度分化的表型，变成成纤维细胞样或间充质表型。该过程涉及细胞间黏附和细胞间连接的损失、基底膜的破坏、肌动蛋白细胞骨架的重组、增强的迁移能力和侵袭力、转录因子的激活以及上皮标志物的下调和间充质基因的表达[15]。EMT的分子和形态特征通常与组织学分化差、组织完整性破坏相关，并且一般与疾病的进展和组织功能的恶化有关[11]。肝细胞癌是一种上皮源性肿瘤，转移和复发是肝癌治疗过程中的主要障碍。研究表明，EMT与肝癌侵袭、肝内转移及低存活率密切相关[13]。本研究以SMMC-7721细胞作为模型细胞，观察PI3K/Akt信号通路中PDK1、Akt、PTEN在肝癌细胞迁移、侵袭和蛋白表达中的作用。结果显示，OSU03012下调了原癌基因PDK1，抑制了肝癌细胞SMMC-7721的迁移和侵袭；化学激动剂SC79上调了原癌基因Akt的蛋白表达，化学抑制剂VO-Ohpic抑制了抑癌基因PTEN的蛋白表达活性，两者均可以促进肝癌细胞的迁移和侵袭。也就是说，抑制PTEN与促进Akt产生的效应相同。以上研究均说明了PI3K/Akt信号通路在肝癌中的作用机制。

异常的磷酸化作用会引起异常的信号转导，观察基因对肝癌细胞磷酸化的影响对于进一步研究PI3K/Akt通路与肝癌之间的关系有重要意义[16]。本研究同时观察了PDK1基因在磷酸化水平上的蛋白表达，对于深入了解该信号通路在肝癌中的作用有重要意义。在本研究中，采用PDK1抑制剂的方法抑制PDK1蛋白表达，观察到p-PDK1表达降低，与PDK1的变化趋势一致；EMT相关蛋白E-cadherin表达减低，而Vimentin表达增高。有研究表明，E-cadherin表达下调可以启动细胞的EMT，而N-cadherin表达增加与EMT呈正比[16]。说明在肝癌中如果PDK1蛋白表达下调，则肝癌细胞EMT水平也会下调。

综上所述，抑制PI3K/Akt信号通路中PDK1表达可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭，并抑制肝癌细胞的EMT水平；促进Akt和抑制PTEN表达可以促进肝癌细胞迁移和侵袭。由此推测PDK1、Akt、PTEN三个基因在肝癌发展中起到一定作用，为肝癌的靶向治疗提供了潜在的靶点。