雷公藤多苷治疗对中重度类风湿关节炎患者外周血单个核细胞miR-146a表达的影响

张英，韩俊

(江汉大学附属医院，武汉430015)

类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，以慢性进展的关节滑膜炎症为特征。它主要引起关节疼痛和肿胀，若未积极治疗，将最终导致关节畸形和残疾并严重影响患者生活质量[1]。雷公藤多苷(TwHF)是一种传统中药，其可通过抑制炎性细胞和炎性因子的产生，从而缓解RA病情。微小RNA(miRNA)是一种内源性单链小分子RNA。通过与mRNA结合抑制翻译或造成mRNA被酶解、切割而起到基因调控的作用[2]。有研究表明，miR-146a在RA和其他自身免疫性疾病中发挥重要作用[3，4]。但miR-146a在TwHF治疗RA中的作用尚不清楚。本研究通过观察RA患者应用TwHF治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)中miR-146a表达的变化，评价miR-146a表达变化与RA患者临床应答的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2016年12月在我院就诊的中重度活动性RA患者62例，男22例、女40例，年龄(45.45±15.91)岁，病程11～27个月。纳入标准：符合2010年ACR/EULAR关于RA的分类标准；年龄18～65岁；疾病处在中度至重度活动性，定义为28关节疾病活动度(DAS28)≥3.2分；经甲氨蝶呤(MTX)或来氟米特(LEF)单药治疗效果不佳。排除标准：患有严重关节变形或接受过关节手术者；6个月内接受过TwHF、生物制剂或抗风湿病情药物(DMARDs)联合治疗者；合并肝肾功能严重异常、恶性血液疾病或恶性实体肿瘤、严重感染者；妊娠或哺乳期妇女；认知功能障碍或难以进行项目评估者；因难以耐受治疗或治疗无效退出研究者；治疗过程中失访者。另选择性别、年龄匹配的60例健康志愿者作为对照组，男25例、女35例，年龄(43.72±13.84)岁。本研究获得本院伦理委员会同意和批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 RA患者给予TwHF治疗，20 mg/次、3次/d，连续24周。根据患者病情，可联合MTX或LEF治疗。

1.3 疗效评价方法 在RA患者接受治疗的基线期、12周、24周分别评估DAS28评分，根据治疗24周后DAS28评分下降情况，将患者分为临床应答和临床不应答两个水平。临床应答参考EULAR标准，定义为治疗24周后DAS28评分下降≥1.2分。

1.4 PBMC中miR-146a表达检测 采集RA患者基线期、12周、24周和对照组基线期外周血5 mL，EDTA抗凝，密度梯度离心法分离PBMC。采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a表达。使用TRIzol RNA分离试剂盒分离总RNA，然后逆转录合成cDNA。以U6作为miRNA内参，严格按照KAPA SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂盒使用说明书进行实时定量PCR反应。引物序列：miR-146a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATG-3′，下游引物5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算miR-146a的相对表达量。

2 结果

2.1 RA组和对照组PBMC中miR-146a表达比较 RA组和对照组PBMC中miR-146a的相对表达量分别为1.051(0.789，2.243)和2.906(1.860，3.953)，RA组PBMC中miR-146a表达高于对照组(P<0.01)。

2.2 RA患者TwHF治疗前后PBMC中miR-146a表达变化 RA患者基线期、12周、24周时PBMC中miR-146a相对表达量分别为2.906(1.860，3.953)、2.296(1.456，4.183)和1.670(0.664，3.012)，12、24周时均较基线期下降，24周时较12周时下降(P均<0.01)。

2.3 RA患者TwHF治疗临床应答和临床不应答者基线miR-146a表达比较 62例RA患者中，临床应答34例，临床不应答28例，二者基线期的miR-146a相对表达量分别为2.386(1.729，3.307)和3.240(2.015，4.174)，临床应答者的基线期miR-146a表达高于临床不应答者(P<0.05)。

2.4 RA患者TwHF治疗临床应答与不应答者的临床指标比较 见表1。临床应答者基线期CRP水平高于临床不应答者(P=0.018)。

2.5 RA患者TwHF临床应答的影响因素 将单因素Logistic回归中P<0.1的因素进一步纳入多因素Logistic回归，结果显示，miR-146a(P=0.205)和CRP(P=0.155)均与TwHF治疗RA的临床应答无关。见表2。

表1 RA患者TwHF临床应答和不应答者的临床指标比较

表2 影响临床应答因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

miR-146家族主要包括miR-146a和miR-146b基因，两个基因分别位于人的第5、10号染色体，两者的成熟序列仅相差2个碱基，这两个miRNA在有些细胞中功能相近，但miR-146a仅在Treg细胞中高度表达[5]。研究表明，miR-146a是参与炎性疾病发病机制的几种miRNA之一。稳态的miR-146a表达对于Th1细胞的反应及相关自身免疫性疾病起重要作用。其中，RA作为典型的Th1细胞反应及自身免疫性疾病受到众多学者的关注。大量研究表明，miR-146a可以通过调节炎症免疫应答来影响RA的进展。miR-146a过表达可能会抑制TRAF6、IRAK1的产生进而导致超免疫炎症反应[6]；刺激Th1细胞产生IL-2、IL-12和干扰素γ(IFN-γ)来促进RA的炎症[7]；通过NF-κB通路，诱导各种促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌[8]；以IL-17为靶向，促进T细胞的产生从而诱导RA患者的炎症反应[8]。Mookherjee等[9]报道，RA患者PBMC中miR-146a和miR-155表达水平较正常人升高。Filipowicz等[10]报道，miR-146a在RA患者滑膜成纤维细胞(RASFs)中的表达水平高于骨关节炎患者。通过向体外RASFs培养基中添加一系列炎症因子(IL-1、LPS、TNF-α)模拟RA的炎性环境，结果显示，LPS和IL-1均可诱导miR-146a上调。由此推测，RA患者中可能由于发炎的滑膜中存在前炎症细胞因子和趋化因子而导致miR-146a水平表达升高，miR-146a上调可能又通过核因子κB(NF-κB)通路，诱导各种促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌，或者刺激Th1细胞产生IL-2、IL-12、IFN-γ等，从多条通路促进RA的炎症发展。本研究结果显示，miR-146a在RA患者PBMCs中的表达水平高于对照组，与以往研究结果相符。提示miR-146a具有作为诊断RA生物标志物的潜能。

TwHF的主要有效成分是雷公藤甲素。研究显示，雷公藤甲素可以降低免疫功能或宿主防御相关基因的表达，例如促炎细胞因子和趋化因子，包括TNF-α、IL-1β、CCL-1、CCL-2等。此外，既往研究表明，细胞间黏附分子1(ICAM-1)、层粘连蛋白等黏附分子以及NF-κB、激活转录因子3(ATFA3)等转录因子和信号转导和转录激活因子5(STAT5)也能被TwHF抑制[11]。研究发现，RA患者接受TwHF治疗后，miR-146a表达水平降低，且疾病活动减弱[12]。另有研究显示，接受抗TNF药物治疗的RA患者和未接受抗TNF药物治疗的RA患者的miR-146a表达差异无统计学意义[6]。Abou-Zeid等[13]认为，其原因可能是抗TNF治疗反应未完成，或者是仅一小部分患者对治疗有应答。本研究结果显示，TwHF治疗可降低RA患者PBMC中miR-146a的表达水平。其原因可能是TwHF通过抑制RA患者NF-κB的表达，依赖NF-κB上调的miR-146a通路被阻断，致使miR-146a表达下调或无法上调，从而减少炎性因子的分泌，进而达到缓解RA的作用。

关于miR-146a表达水平对TwHF治疗RA应答的影响目前研究较少。本研究发现，临床应答者基线期miR-146a表达水平高于临床不应答者，提示miR-146a表达水平升高可能影响TwHF治疗RA的临床应答。其可能原因有：①miR-146a是一个很强的促炎因子，其含量越高表明患者炎症越重，疾病活动度越高。因此，疾病活动度高的RA患者有更大的DAS28下降空间，更容易达到临床应答。②miR-146a高表达可能与患者对TwHF治疗的敏感性有关，但目前尚无研究证明，需要我们进一步研究观察。单因素Logistic回归显示,miR-146a和CRP与临床应答均有关联，因此在多因素Logistic回归时两者可能相互干扰，未得到miR-146a对RA患者TwHF治疗应答的独立相关作用。

本研究存在一定的局限性：①本研究中RA患者在接受TwHF的同时合用MTX或LEF进行治疗，这对结果可能存在干扰。但本研究入组患者为经单独使用MTX或LEF治疗效果不佳的患者，因此其联合使用对研究结果影响较小，并且我们采用了单因素及多因素回归分析来排除MTX或LEF联用对结果的干扰。②本研究样本量相对较小，仅纳入62例患者，因此缺乏统计效能。③本研究随访周期较短，因此miR-146a对TwHF治疗RA患者的长期疗效的影响未能评估。

综上所述，RA患者PBMCs中miR-146a表达水平上调，其基线期表达水平升高可能影响TwHF治疗RA的临床应答。