越橘花青素对人胚胎巩膜成纤维细胞MMP2和collagen I表达的影响*

刘丽敏， 钟华红， 邓宏伟， 肖红萍， 曾杞汶， 田 原， 刘小勇， 孟 晶△

(1暨南大学附属第一医院眼科， 广东 广州 510632； 2暨南大学附属深圳眼科医院， 广东 深圳 518040)

高度近视幼儿长期口服含越橘花青素(bilberry anthocyanins)的递法明片剂，其眼轴增长以及近视的进展可被延缓[1]。前期动物模型实验显示越橘花青素能够抑制豚鼠形觉剥夺性近视的眼轴增长，使巩膜组织中基质金属蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)表达减少及I型胶原蛋白(collagen type I,collagen I)表达增加[2]。本研究以人胚胎巩膜成纤维细胞(human fetal scleral fibroblasts，HFSF)为研究对象，探讨越橘花青素对HFSF近视相关蛋白MMP-2和collagen I表达的影响，为深入研究近视信号通路寻找突破点，并为近视的药物治疗寻找新的方法。

材 料 和 方 法

1 细胞

人胚胎巩膜成纤维细胞由中山大学眼科中心惠赠。

2 试剂

越橘花青素冻干粉(从欧洲越橘果实提取的混合物，花青素含量占其总重量的55%)由法国乐康美的澜制药厂惠赠；Western封闭液、蛋白彩色Marker、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液(5×)和 BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购于碧云天生物工程有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)和SYBR® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)购于TaKaRa；所用引物由上海生物股份有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

3 方法

3.1HFSF的复苏、传代与培养 将HFSF复苏、常规培养，当细胞生长接近80%～90%融合时进行传代培育，倒置相差显微镜下察看细胞的密度及形态。

3.2MTT法检测越橘花青素对HFSF活力的影响 将越橘花青素依次配制为0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1和1 g/L各浓度组[3]，其中0 g/L为实验对照组，不含HFSF的培养液为空白对照组，分别培养6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法检测HFSF增殖，每组浓度设3个平行复孔，实验共重复3次。

3.3流式细胞术检测越橘花青素对HFSF细胞周期和凋亡的影响 MTT检测HFSF活力最高时越橘花青素的浓度为实验组，0 g/L为对照组，DMEM高糖培养液分别培养HFSF 12 h， 碘化丙啶(propidium iodide，PI)单染法检测细胞周期，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，每组设3个复孔，实验重复3次。

3.4RT-qPCR检测HFSF中MMP2、 COL1A1和COL1A2 mRNA的表达 取生长状态良好的接近融合的细胞，消化、离心、制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×108/L，每个培养瓶加3 mL细胞悬液，倒置显微镜下观察，5% CO2、37 ℃恒温培养箱内孵育24 h后，吸除原培养液，用含10-1g/L越橘花青素的DMEM高糖培养液分别处理细胞12 h，不含越橘花青素组为对照组，应用RT-qPCR分别检测HFSF中MMP2、COL1A1 和COL1A2 mRNA表达，每组设3个复孔。扩增条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

3.5Western blot检测HFSF中MMP2和collagen I蛋白的表达 按照上述方法培养HFSF，应用Wes-tern blot分别检测2组HFSF中MMP2和collagen I蛋白表达，每组设3个复孔。用RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，BCA法测定提取的总蛋白含量及浓度。20 μL蛋白裂解液中加入5 μL 2×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，100 ℃煮沸5 min；采用10% SDS-PAGE，每泳道30 μg蛋白量加样，电压140 V电泳1.5 h；电流350 mA进行转膜1 h，将SDS-PAGE胶上的蛋白转到PVDF膜上。PVDF膜使用BSA室温封闭2 h，200倍稀释的Ⅰ抗4 ℃孵育过夜；PBST洗涤4次后，Ⅱ抗室温孵育1 h；PBST洗涤5次，化学发光法显影。扫描胶片，Quantity One软件分析条带灰度值。

4 统计学处理

使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据均用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HFSF的镜下形态

倒置相差显微镜下观察，刚贴壁的HFSF密度较低，轮廓清晰，形态多呈三角形或星形、网状排列；生长过程中细胞逐渐延伸至梭形，呈束状或旋涡状排列，见图1。

Figure 1. The morphological changes of HFSF observed under inverted microscope (×50). A: 48 h after inoculation; B: 96 h after inoculation.

图1倒置显微镜下观察HFSF的形态

2 越橘花青素对HFSF活力的影响

MTT检测显示，不同作用浓度、作用时间及不同组合间的细胞活力差异有统计学意义(P<0.05)；浓度为10-1g/L的越橘花青素作用12 h， HFSF活力最高(P<0.05)，用于后续实验，见图2。

Figure 2. The promoting effect of bilberry anthocyanins on the viability of HFSF. Mean±SD.n=12.*P<0.05vs0 g/L group.

图2越橘花青素对HSFS活力的促进作用

3 越橘花青素对HFSF细胞周期的影响

PI单染流式细胞术检测对照组及实验组的细胞周期，结果显示，实验组(10-1g/L越橘花青素作用12 h)和对照组(0 g/L)中，S+G2期细胞所占百分比分别为(28.92±1.69)%和(22.41±1.42)%，实验组高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图3、表2。

4 越橘花青素对HFSF凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法检测显示，越橘花青素浓度10-1g/L、作用时间12 h的实验组与对照组的凋亡率分别为(2.0±0.2)%和(2.1±0.2)%，差异没有统计学意义，见图4。

5 越橘花青素对HFSF中MMP2、COL1A1和COL1A2 mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，实验组MMP2的mRNA表达量较对照组明显降低，差异具有统计学意义(P< 0.05)，见图5；COL1A1的mRNA表达量较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P< 0.05)，见图6；而COL1A2的mRNA表达量与对照组的差异没有统计学意义，见图7。

6 越橘花青素对HFSF中MM2和collagen I蛋白表达的影响

Western blot结果显示,实验组和对照组蛋白表达量比较，MMP2蛋白表达减少，collagen I蛋白表达增加，差异具有统计学意义(P< 0.05)，见图8。

讨 论

近视的发生机制至今尚不清楚，但较为公认的理论是巩膜重塑机制。我们前期的研究表明，在形觉剥夺性近视的动物模型中，越橘花青素延缓眼球增长和负向屈光不正的作用机制是通过抑制后极部巩膜MMP2的mRNA和蛋白表达，促进collagen I的mRNA和蛋白表达，从而调节剥夺眼的巩膜重塑过程[3]。越橘花青素属生物黄酮类化合物，具备抗氧化、抗辐射、抗炎症、抗动脉硬化、抗肿瘤、调理抗氧化酶系统的表达及维护眼球健康和视觉生理等多种功能[4-6]。不同花青素对各种细胞组织的作用不同。有研究证实，葡萄籽原花青素可使高血压心肌组织collagen I 表达增加[7]；蓝莓提取物花青素使氧化应激诱导肝星状细胞中collagen I表达减少[8]；原慧萍等[9]研究显示花青素具有拮抗视网膜神经节细胞微波损伤凋亡的作用。正常或近视巩膜中分泌细胞外基质的主要细胞是HFSF，因此本实验选取HFSF为对象设计离体实验，从细胞水平探讨越橘花青素对HFSF中MMP2及collagen I表达的影响。

Figure 3. The effect of bilberry anthocyanins on the cell cycle of HFSF.

图3越橘花青素对HFSF细胞周期的影响

表2 HFSF细胞周期的比较

**P<0.01vscontrol group.

Figure 4. The effect of bilberry anthocyanins on the apoptosis rate of HFSF. Mean±SD.n=12.

图4越橘花青素对HFSF凋亡的影响

Figure 5. The effects of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of MMP2 in HFSF. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

图5越橘花青素对HFSF中MMP2mRNA表达的影响

Figure 6. The effect of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of COL1A1 in HFSF. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

图6越橘花青素对HFSF中COL1A1mRNA表达的影响

Figure 7. The effect of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of COL1A2 in HFSF. Mean±SD.n=4.

图7越橘花青素对HFSF中COL1A2mRNA表达的影响

Figure 8. The effect of bilberry anthocyanins on the protein expression of MMP2 and collagen I in HFSF tested by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

图8Westernblot检测越橘花青素对HFSF中MMP2和collagenI蛋白表达的影响

本实验使用0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1 g/L浓度的越橘提取物作用于HFSF 6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后，通过MTT法检测出，细胞活力最高的作用时间为12 h，培育浓度为10-1g/L。流式细胞分析图的Q2-LL区为正常细胞，Q2-LR区显示为早期凋亡细胞比例，Q2-UR区显示为晚期凋亡细胞比例，Q2-UL区显示为机械损伤细胞比例。流式细胞术检测结果显示，10-1g/L越橘花青素组S+G2期的HFSF细胞比例增加。此外，与对照组(0 g/L)相比，10-1g/L越橘花青素组(实验组)对HFSF凋亡率没有影响。

巩膜是视觉信号通路的终点，巩膜胶原成分占巩膜总干重的90%左右，其中主要分布于赤道和后极部之间的collagen I占巩膜总胶原量的绝大部分。Collagen I是人体中最丰富的胶原蛋白，广泛存在于软骨、骨、肌腱、皮肤和眼球的巩膜等结构中，形成嗜酸性的大胶原纤维，起到加强并支持结构的作用[10]。Collagen I的主要成分包含alpha-1和alpha-2两种单链，分别由COL1A1和COL1A2基因编码，二者表达生成的2条alpha-1单链和1条alpha-2单链，组合后形成I型原胶原蛋白[11-12]。巩膜的重塑需要其基质合成和降解之间的精细平衡。基质金属蛋白酶是一系列能降解多种大分子的酶，其中MMP2能降解巩膜中成分最多的天然形式的collagen I。形觉剥夺性近视鸡多个研究表明，形觉剥夺眼在早期(4 d)MMP2 mRNA 含量即有增加，而恢复期其含量会减少，从而证明巩膜MMP2 表达水平与近视的发生明显相关[13]。Gentle等[14]采用树鼠作为近视模型动物，检测出近视眼中collagen I mRNA含量与对照眼相比显著减少，说明MMP2和collagen I在近视的发展过程中密切相关。

我们选取MTT法检测细胞活力最高的浓度10-1g/L的越橘花青素作为实验组，0 g/L越橘花青素组为对照组，作用于HFSF进行RT-qPCR及Wes-tern blot测定，分别从mRNA及蛋白水平检测MMP2和collagen I表达。结果显示越橘花青素作用组MMP2表达量下降，collagen I表达量增加。从细胞水平证实了越橘花青素可对体外培养的人巩膜成纤维细胞的MMP2表达产生抑制作用，使其mRNA含量及蛋白合成量均下降，促进collagen I mRNA及蛋白表达,与动物实验结果相一致。对于越橘花青素具体通过何种通路诱导HFSF表达collagen I蛋白，有待进一步深入探讨。