Nrf2对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞中IKKs表达的影响*

李秀英， 张卫东， 江 刚

(湖南省人民医院呼吸内科， 湖南 长沙 410006)

烟雾暴露对呼吸道免疫功能、肺部结构和肺功能均产生影响，引起多种呼吸系统疾病。而气道上皮是肺部抵御外界理化因素刺激的第一道防线。病原微生物及外界有害的微尘颗粒和气体等因素导致的气道上皮损伤是慢性肺部疾病的起始环节和病理基础。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-rela-ted factor 2,Nrf2)是近年新发现的机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路[1]。我们的前期研究认为,Nrf2在慢性阻塞性肺疾病的发病过程中有抗炎和抗氧化的作用，而IκB激酶家族(IκB kinases,IKKs)/核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信号途径广泛参与了多种炎性疾病及肿瘤的发生发展，在气道疾病中亦有关键作用[2-3]。在多数情况下，NF-κB的激活需要依靠IKKs的激活。为进一步明确Nrf2在烟草提取物诱导的人支气管上皮细胞中与IKKs的关系，本实验以支气管上皮细胞为研究目标，予以香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激，使其产生氧化应激和炎症反应，同时采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制Nrf2的表达或采用15-脱氧前列腺素J2(15-deoxy-prostaglandin J2,15d-PGJ2)预处理增加Nrf2的表达，观察IKKs在气道上皮细胞的表达。

材 料 和 方 法

1 主要材料

正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelial，NHBE)细胞株购于中南大学湘雅医学院细胞中心；胎牛血清和兔抗鼠NF-κB p65抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗Nrf2和IKKα/β抗体及抗β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz；15d-PGJ2购自Merck；Nrf2 siRNA及阴性对照siRNA(negative control siRNA,NC-siRNA)由上海吉玛生物合成；TRIzol试剂、LipofectamineTM2000试剂、Taq DNA聚合酶混合物和RT-PCR试剂盒购自Invitrogen；MTT试剂盒购自南京凯基生物；ECL检测试剂盒购自Sigma。CSE参考江刚等[4]的制作方法。

2 方法

2.1人支气管上皮细胞的培养 取正常人支气管上皮细胞株解冻复苏后加入含10%小牛血清的DMEM培养液，制成细胞悬液，分种于培养瓶中，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境的培养箱中贴壁培养，每隔2～3 d 换培养液 1 次，待细胞生长达80%融合时，用0.125%胰酶和0.02% EDTA消化细胞，相差显微镜下见细胞收缩，细胞间隙清晰，立即翻转培养瓶使细胞离开消化液，弃去消化液，之后加入10%小牛血清的DMEM培养液，按2×105的密度将细胞接种于6 孔板中，使细胞生长再次达到70%融合用于实验。根据细胞毒性MTT方法检测结果，确定CSE处理NHBE细胞浓度为5%，作用时间为24 h，无明显细胞毒作用且不同时段细胞存活率有下降趋势，可以适用于后续实验。

2.2siRNA干扰实验 转染前 1 d，取(4～5)×104个细胞接种在6孔板上，用2 mL含FBS的基础培养基，在24 h 内使细胞汇合达到70%。使用LipofectamineTM2000转染siRNA。37 ℃、CO2培养箱孵育24～72 h，直到适合分析(6 h取出 FAM荧光标记的对照siRNA转染孔，放置荧光镜下观察转染效率，保证转染效率达到70%以上)。找出干预效果最好的一个siRNA片段，另加一个转染效率检测组(FAM荧光标记的对照siRNA)，转染时保证转染率达到70%以上。RT-PCR鉴定确认RNA干预的效果，根据RT-PCR检测结果，确定siRNA沉默效果最好的基因序列：sense：5’-AGAUUUAGAUCAUUUGAAATT-3’；anti-sense：5’-UUUCAAAUGAUCUAAAUCUTG-3’。

2.3细胞分组 本实验设正常对照(control)组、 CSE刺激(CSE)组、15d-PGJ2预处理后CSE刺激(15d-PGJ2+CSE)组和Nrf2 siRNA转染后CSE刺激(Nrf2 siRNA+CSE)组，每组5个复孔。15d-PGJ2干预的浓度为10 μmol/L，作用30 min[3]。

2.4RT-PCR法检测mRNA的表达 用TRIzol试剂一步法提取组织RNA，按照3步逆转录PCR试剂盒(MBI)说明书进行逆转录反应，以获得的cDNA为模板，采用一步法进行PCR扩增。引物序列见表1，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用Labworks 4．5分析软件对PCR产物进行分析。

表1 目的基因的引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5Western blot 法检测蛋白表达 参考分子克隆指南，提取总蛋白，测定总蛋白含量，取50 μg样品进行SDS-PAGE，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶500的兔抗Nrf2和IKKα/β抗体，37 ℃温育2 h后，弃去 I 抗，加入羊抗兔的 II 抗，37 ℃温育 1 h，根据ECL检测试剂盒检测特异性蛋白条带。蛋白的相对表达为目的基因灰度值/内参照(GAPDH)灰度值。

3 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 支气管上皮细胞中各因子mRNA的表达

CSE干预支气管上皮细胞后，Nrf2和IKKα/β的mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)；采用15d-PGJ2预处理后，Nrf2的mRNA较CSE单用刺激组表达明显升高，而IKKα/β的mRNA较CSE单用刺激组表达明显降低(P<0.05);而进行Nrf2 siRNA转染的支气管上皮细胞中Nrf2的mRNA被抑制，IKKα/β的mRNA较CSE单用刺激组表达却明显升高(P<0.05)，见图1、表2。

Figure 1. The images of agarose gel electrophoresis for analyzing the mRNA expression of Nrf2, IKKα and IKKβ in the NHBE cells. M: DL2000 DNA marker; L1: control group; L2: CSE group; L3: 15d-PGJ2+CSE group; L4:Nrf2 siRNA+CSE group.

图1琼脂糖凝胶电泳分析Nrf2、IKKα和IKKβ的mRNA表达

表2支气管上皮细胞中各目标基因的mRNA表达

Table 2. The mRNA expression of target genes in NHBE cells (Mean±SD.n=5)

GroupNrf2IKKαIKKβControl0．51±0．030．46±0．010．49±0．01 CSE0．60±0．01∗0．70±0．02∗0．72±0．01∗ 15d⁃PGJ2+CSE0．87±0．02#0．59±0．01#0．58±0．01# Nrf2siRNA+CSE0．17±0．03#0．81±0．01#0．88±0．02#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

2 Western blot检测各组细胞中Nrf2和IKKα/β的表达

CSE刺激支气管上皮细胞后，Nrf2，IKKα/β的蛋白表达均明显升高(P<0.05)，采用15d-PGJ2预处理后，Nrf2的水平较CSE单用刺激组表达明显升高，而IKKα/β的水平较CSE单用刺激组表达明显降低(P<0.05)；而进行Nrf2 siRNA转染的支气管上皮细胞中Nrf2的蛋白表达被抑制，IKKα/β的蛋白水平较CSE单用刺激组表达却明显升高(P<0.05)，见图2、表3。

讨 论

IKK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是NF-κB信号通路中的关键成员。经典IKK家族成员包括有IKKα和IKKβ，在大多数细胞中均有表达。

Figure 2. The protein expression of Nrf2, IKKα and IKKβ in the NHBE cells.

图2NHBE细胞中各目标基因的蛋白表达情况

表3细胞中各目标基因的蛋白表达情况

Table 3. The protein expression of target genes in NHBE cells (Mean±SD.n=5)

GroupNrf2IKKαIKKβControl0．17±0．000．19±0．010．22±0．01 CSE0．29±0．01∗0．36±0．01∗0．38±0．02∗ 15d⁃PGJ2+CSE0．46±0．02#0．25±0．01#0．26±0．01# Nrf2siRNA+CSE0．17±0．00#0．43±0．02#0．46±0．01#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

静息状态下，NF-κB位于胞质中，与IκB结合，以复合体的形式存在，此时活性被IκB所抑制。而一旦IKK被激活，即可诱发IκB的磷酸化而降解失活。NF-κB失去IκB抑制而活化，从细胞质转移到细胞核内，与靶基因位点结合，迅速诱导靶基因的转录，启动一系列炎症目标因子的转录[5-6]。

吸烟是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)和肺癌的重要病因，香烟烟雾是呼吸道最常见的外界应激因子。本实验以人支气管上皮细胞株为研究对象，采用CSE刺激支气管上皮细胞，使其处于氧化应激的损害中，氧化应激反应中关键的核转录因子Nrf2的表达增加;而15d-PGJ2能进一步促进Nrf2的激活，使其表达水平上升;使用siRNA技术抑制了Nrf2，观察炎症转录因子激活酶IKKα/β的表达改变。结果显示在CSE的刺激下，IKKα/β的mRNA及蛋白水平均有明显的增高，说明CSE刺激可激活支气管上皮细胞内的IKKα/β。而在Nrf2的诱导剂15d-PGJ2静脉注射干预后，Nrf2的表达进一步增加，IKKα/β的mRNA及蛋白水平均较单一CSE刺激组明显的降低；在Nrf2 siRNA干预后，Nrf2的表达得到明显抑制,再予以香烟烟雾提取物刺激，发现IKKα/β的水平均较单一CSE刺激的正常支气管上皮细胞明显升高。因此，香烟烟雾诱导支气管上皮细胞被氧化应激激活后，核转录因子Nrf2表达改变了炎症转录因子NF-κB上游IκB的激酶IKKs的表达，Nrf2高水平表达能抑制IKKs在人支气管上皮细胞中的表达。

COPD和肺癌是呼吸道的常见疾病，发病率高，社会经济负担重。而吸烟是它的重要发病因素，也是活性氧化物的主要来源，随着社会工业化程度的快速发展，大气污染也是一个不可忽视的活性氧化物来源，这2种疾病的发生率和死亡率持续上升，因此，找到准确的治疗靶点已经迫在眉睫。而Nrf2和IKKs广泛参与了急慢性炎性疾病和肿瘤的发生发展[7-10]，因此进一步明确Nrf2和IKKs之间的调控机制有广阔的应用前景。