响应面分析法优化超声波辅助酶法提取南五味子多糖工艺的研究

胡琴汉, 汪 伟, 罗应彪, 杜 芳, 仰榴青, 赵 婷

江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013

五味子是木兰科植物五味子(Schisandrachinensis)的成熟干燥果实，根据分布的位置不同，可分为北五味子和南五味子(Kadsuralongipedunculata)，前者分布在我国东北和华北地区，后者分布在华中地区。五味子是一种常见的滋补性中药，具有极高的药用和食用价值，已被列入保健食品名单[1～3]。研究发现五味子多糖作为五味子中主要的活性成分[4]，其含量较高，具有抗氧化[5]、抗衰老[6]、抗肿瘤[7]、免疫调节[8]、降低血糖[9]及保肝护肝[10]等多种生物活性，且对机体正常细胞和组织的毒性极小，是目前功能食品研究的热点之一。但目前关于五味子提取纯化、结构及活性方面的研究多集中于北五味子，而对于南五味子的研究较少。本课题组在前期的研究中发现，采用传统水提法提取南五味子多糖，最终粗多糖得率可达到12.91%，糖含量高达36.37%[11]。可见南五味子的多糖含量较为丰富，具有较好的研究和应用价值。

目前关于多糖的提取方法有很多，包括热水浸提法[12]、超声波辅助提取法[13]、微波辅助提取法[14]和酶辅助提取法[15]等。但工业生产上多糖的提取主要以传统的热水浸提法为主，该法提取时间长、能耗高、产率低。因此，寻找新的适用于工业生产的有效提取方法成为当前多糖研究的重点。超声波辅助提取法利用超声波强大的震荡产生的空化作用破坏植物细胞壁，使植物有效成分扩散到溶剂中以提高提取效率。酶辅助提取法利用特异性酶分解破坏植物细胞壁来提高提取效率。超声波辅助酶法是结合超声波法和酶法的一种新型的提取方法，已广泛应用于天然活性成分的提取。王彦平等[16]通过超声波辅助酶法提取紫山药多糖，提取时间仅需25 min，多糖产率达到9.83%，且所得多糖具有较好的抗氧化活性。与常规超声波辅助提取法相比，该法提取多糖时间缩短66.7%，且产率略有提高[17]。邹烨等[18]以中华鳖裙边为原料，采用超声波酶法辅助提取胶原蛋白，最终产率可达74.5%，比常规酶法提取产量提高了约14%，且提取的胶原蛋白热稳定性显著高于常规酶法提取[19]。可见，超声波辅助酶法能有效提高提取效率，降低能耗，缩短提取时间，具有较好的应用前景。

本研究基于超声波辅助提取法和酶辅助提取法的优点，采用超声波辅助酶法提取南五味子多糖，并以单因素实验结果为基础，采用响应面分析法对南五味子多糖的提取工艺进行了优化研究，以期为南五味子多糖的深入研究和多糖产品的开发应用提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

实验中五味子购于江苏中兴药业有限公司，经粉碎烘干后备用。

实验所用果胶酶与纤维素酶均为食品级，酶活力分别为：10 000 U/g 和50 000 U/g；95%乙醇，石油醚(60～90℃)和盐酸等试剂均为分析纯。

电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；数控恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)； 101型电热鼓风干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂)；DT5-1B低速离心机(北京时代北利离心机有限公司)； FD-1A-50冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1材料的预处理 称取100 g干燥五味子粉末于2 000 mL圆底烧瓶，加入500 mL石油醚(60～90℃)，70℃回流1 h，重复脱脂3次。脱脂后，南五味子于65℃烘干，备用。

1.2.2南五味子粗多糖的提取 称取脱脂后南五味子粉末5 g于圆底烧瓶，加入适量蒸馏水和复合酶(纤维素酶：果胶酶=1∶1)，用稀盐酸调节pH在250 W超声波下恒温热水浴特定时间。反应结束后取上清液，旋蒸至50 mL，加入4倍体积的95%乙醇，4℃过夜，5 000 r/min离心10 min，弃去上清得到粗多糖沉淀，沉淀经挥醇、冷冻干燥后得到五味子粗多糖粉末，称重并计算产率。

1.2.3单因素试验 根据文献和预实验，将超声波功率和料液比分别固定为250 W和1∶30。对提取温度、提取时间、反应pH和酶用量分别进行单因素实验。反应温度选取40℃、50℃、60℃、70℃和80℃ 5个水平；提取时间选取30 min、40 min、50 min、60 min和70 min 5个水平；反应pH选取5个水平：3、4、5、6、7；酶的用量选取1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5% 6个水平。

1.2.4响应面实验设计 以单因素实验为基础，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，将影响多糖得率的3个主要因素(提取pH、提取温度和提取时间)进行组合，以粗多糖得率(Y)为响应值，确定中心组合试验的因素与水平，进行响应面试验来优化南五味子多糖提取的工艺条件。响应面实验因素水平见表1。

表1 响应面试验设计的因素和水平Table 1 Factors and levels of RSM design.

2 结果与分析

2.1 超声辅助酶法提取南五味子多糖的单因素实验分析

2.1.1提取pH对南五味子多糖得率的影响 在提取时间30 min，反应温度40℃，酶用量为1.0%的条件下，考察反应pH对五味子多糖得率的影响。由图1可知，多糖的提取效率随pH先增大后减小，当pH<5时，多糖得率随pH上升而增加，当pH=5时，多糖得率达到峰值为6.2%，当pH>5后，多糖得率开始下降，这可能是因为pH为5时酶的活性最高，有利于多糖的溶出[20]。因此本实验选取pH=5为最佳pH。

图1 提取pH对南五味子多糖提取得率的影响Fig.1 Effects of extraction pH on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.2提取温度对南五味子多糖得率的影响

在提取时间30 min，反应pH=5，酶用量为1.0%的条件下，考察反应温度对五味子多糖得率的影响。如图2所示，多糖得率随反应温度先升后降，在反应温度为60℃时达到峰值7.87%。当温度升高时，分子运动加剧，反应效率增加，且多糖的溶解度增加，故多糖得率也增加，但当温度过高时，酶的活性降低甚至失活，导致反应效率下降，多糖提取得率下降。故选取60℃作为最佳反应温度。

图2 提取温度对南五味子多糖提取得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.3复合酶用量对南五味子多糖得率的影响 在提取时间30 min，反应pH=5，反应温度60℃的条件下，考察复合酶用量对五味子多糖得率的影响。如图3所示，多糖得率随酶用量的增加而升高，但增加速率逐渐降低，当酶用量趋近3.0%时，多糖得率增加趋势减缓。在酶的用量较低时，适当增加酶的用量，能有效提高反应速率。但当酶含量过多时，由于底物浓度一定，多余的酶分子无法与底物结合，效率增加缓慢，故选取3.0%为最佳酶浓度。

图3 复合酶用量对南五味子多糖提取得率的影响Fig.3 Effects of the mount of compound enzyme on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.4提取时间对多糖得率的影响 在反应pH=5，反应温度60℃，酶用量为3.0%的条件下，考察反应时间对五味子多糖得率的影响。如图4所示当反应时间增加，多糖得率随之增加，当反应时间超过60 min时，多糖得率反而下降。可见在一定的提取时间内，随反应时间越长，多糖得率越高，但当提取时间过长时，多糖会在高温下产生水解或结构变性导致得率下降，故选取60 min为最佳提取时间。

图4 提取时间对南五味子多糖得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.2 响应面法优化超声酶辅助提取南五味子多糖的工艺

在单因素实验结果的基础上，采用Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选取影响多糖得率的3个主要因素(提取pH、提取温度和提取时间)进行三因素三水平响应面分析试验，结果见表2、表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of RSM.

表3 得率的方差分析Table 3 The analysis of variance on yield.

以多糖得率为响应值，采用Design-Expert 8软件对实验数据进行回归分析，按照各因素对得率试验结果的影响因素进行二项式拟合，南五味子多糖得率为：Y=8.53-0.18A-0.63B+0.54C+0.062AB-0.017AC-0.085BC-0.70A2-1.09B2-0.52C2

由表3可知，三个影响因素提取pH(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和三个二次项(A2、B2、C2)对南五味子多糖得率具有较显著性影响(P<0.05)，而三个交互作用的影响不显著。模型的F值为56.61(P<0.01)，说明模型显著性极显著。失拟误差F值为0.34，P=0.815，说明检验结果与模型计算结果没有显著性差异。该模型的R2=0.986 4，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，该模型RAdj2=0.969 0，进一步证明该模型拟合程度较好。变异系数(CV)反映模型的置信度，CV值越低，模型的置信度越高，本实验的CV值为2.31%，说明模型方程能够很好的反应真实试验值。由上可知，该模型可用于超声波辅助酶法提取南五味子多糖试验的理论预测。

根据回归方程，作出响应面图(图5,彩图见图版五)，考察拟合响应面的形状，分析提取温度、提取时间、提取pH对南五味子多糖得率的影响。如图5所示，三个因素对多糖的得率都有较显著的影响，其中提取时间的影响最为显著，曲面较陡；影响最小的是提取温度。而三个等高线图均为圆形，说明三个因素之间的交互作用较小。

图5 提取pH、提取温度、提取时间交互作用对南五味子多糖得率影响的响应面图(A、C、E)及等高线图(B、D、F)Fig.5 Response surface map (A、C、E) and contour map (B、D、F) of interaction effect of pH, extraction temperature and extraction time on the yield.(彩图见图版五)

通过响应面法预测得到的得率回归模型分析，超声波辅助酶法提取南五味子多糖的最优工艺条件为：提取pH为4.79，提取时间为65.89 min，提取温度为56.81℃，复合酶用量3.0%。预测最佳得率为8.81%。

2.3 验证试验

为了验证响应面法优化超声波辅助酶法提取五味子多糖工艺的可靠性，根据预测最优工艺及实验操作可行性，将优化工艺参数调整为提取pH 4.8，提取时间66 min，提取温度57℃，复合酶用量3.0%，料液比30 g/mL，超声波250 W条件下进行3次平行试验，得到多糖得率为8.73%。这与响应面模型预测结果较为接近，说明该模型准确可靠，适用于南五味子多糖的提取。

3 讨论

本文采用超声波辅助酶法提取南五味子多糖，按照Box-Benhnken 的中心组合的试验设计原理，以南五味子多糖得率为响应值，通过响应面分析优化得到最优的提取工艺条件：超声波功率250 W、料液比30 g/mL、提取pH为4.8、提取温度56℃、提取时间66 min、复合酶用量为3.0%。在最佳条件下多糖的得率为8.67%。目前国内对五味子多糖的提取工艺多有研究，程振玉等[21]采用超声波辅助酶法提取北五味子多糖，提取时间为2 h，北五味子多糖得率为10.54%。与之相比，本文提取时间仅为其46%，多糖得率达到其得率的83%，可见，本工艺在对多糖得率影响不大的前提下，可有效缩短提取时间。赵婷等[22]采用热水浸提法提取北五味子多糖，提取时间为6 h，提取温度为100℃，北五味子多糖得率为12.91%，与之相比，本文提取时间仅为其1/6，提取温度降低了44%，多糖得率达到其得率的68%，可见，本工艺不仅大大缩短了提取时间，而且大幅度降低了多糖提取的能耗。蒋红等[23]采用响应面法优化大叶南五味子多糖的提取工艺，得到的最佳条件为提取时间2.4 h，提取温度95℃，粗多糖得率为4.6%。与之相比，本工艺提取时间减少了60%，提取温度降低了41%，粗多糖得率提高近90%。可见相较于传统方法，超声波辅助酶法提取可大幅度降低提取温度、节约能耗，并极大的减少提取时间，具有较好的应用前景。该研究为进一步深入研究南五味子多糖结构和活性奠定了基础，为多糖产品的开发利用提供了基础数据。