柠檬酵素对麻鸭免疫功能的影响

阳 刚,白 璐,殷中琼*,魏 琴,杜永华,宋 旭,邹元锋,付羽萍,李 莉,田 野,陈书凡

1.宜宾职业技术学院,四川 宜宾 6440001

2.四川农业大学动物医学院,四川 成都 611130

3.宜宾学院,四川 宜宾 644000

柠檬(Citrus limon)，又名柠果、益母果等，为芸香科柑橘属植物。具有杀菌、美容、提神、润喉、降低胆固醇、预防坏血病、防止肾结石和心血管动脉硬化等功效，是一种营养和药用价值极高的水果，因此被广泛用于食品、化妆品等行业[1,2]。酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果等为原料，经多种有益菌，如乳酸杆菌、酵母菌等发酵而成，含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品[3]。由于其具有增强机体免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗菌、消炎、净化血液等多种保健功能[4-9]，而备受关注。随着人们生活水平的不断提高，人们对畜产品的质量要求越来越高，寻找一种绿色安全饲料添加剂用来替代抗生素具有十分重要的意义。前人研究发现酵素能够显著提高小鼠及肉仔鸡的免疫功能[10,11]。但目前国内外关于酵素对鸭免疫功能的研究报道甚少。本试验从麻鸭血清中免疫球蛋白含量和细胞因子水平等常用的免疫学指标来评估柠檬酵素的免疫增强活性，以期为柠檬酵素的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

柠檬酵素和玉米粉，均由四川省宜宾市高县沙河镇柠檬基地提供。黄芪多糖粉（多糖宝），购于北京生泰尔生物科技有限公司生产。1日龄麻鸭，购于四川省宜宾市高县本地。

1.2 试剂与仪器

Duck IgG ELISA KIT(LOT:201611)， Duck IgA ELISA KIT(LOT:201611)， Duck IgM ELISA KIT(LOT:201611)，Duck IL-2 ELISA KIT(LOT：201611)，Duck IFN-γELISA KIT(LOT:201611)，均由上海酶联生物科技有限公司生产。全波长酶标仪（型号:Varioskan Flash），由Thermo Scientific公司生产，恒温培养箱等。

1.3 试验动物分组与饲养管理

选择体重接近、体质健康的1日龄麻鸭100只，随机分为5组：空白对照组（玉米粉）、阳性对照组（玉米粉+0.5%黄芪多糖）、柠檬酵素I组（玉米粉+48%柠檬酵素）、柠檬酵素Ⅱ组（玉米粉+24%柠檬酵素）、柠檬酵素Ⅲ组（玉米粉+12%柠檬酵素），每组20只。预饲7 d，8日龄开始在试验组玉米粉中按不同浓度添加柠檬酵素，其余时间段均饲喂玉米粉，试验期为28 d。鸭舍为密闭式，采用单层笼上饲养，鸭只自由饮食、饮水。试验前按照常规免疫程序进行免疫，并且对鸭舍进行严格的打扫和消毒。

1.4 血清中IgG、IgA、IgM含量的测定

分别于14、21和28日龄，每组随机选取3只健康鸭，空腹从颈静脉处用真空采血管采血。血样在常温下放置2 h后置4℃过夜，3500 rpm离心10 min，收集血清置于-20℃保存备用。参照IgG、IgA、IgM ELISA试剂盒说明书的方法分别检测血清中IgG、IgA、IgM的含量。

1.5 血清中IL-2和IFN-γ水平的测定

参照IL-2和IFN-γ ELISA试剂盒说明书的方法分别检测血清中IL-2与IFN-γ的水平。

1.6 统计方法

所有数据用平均数±标准差(x±SD)表示，采用软件SPSS22.0进行t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 柠檬酵素对麻鸭血清中IgG含量的影响

在玉米粉中添加柠檬酵素对麻鸭血清中IgG含量影响的测定结果见表1。

表1 柠檬酵素对麻鸭血清中IgG含量的影响Table 1 Effect of lemon enzyme on IgG content in the serum of hemp ducks

由表1可知，14日龄时，柠檬酵素组的IgG含量均高于空白对照组和阳性对照组，与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)，不同浓度柠檬酵素组之间比较差异不显著(P＞0.05)，24%柠檬酵素组的IgG含量最高。21日龄时，柠檬酵素组的IgG含量均高于空白对照组和阳性对照组，显著高于空白对照组(P＜0.05)，不同浓度柠檬酵素组之间比较差异不显著(P＞0.05)，12%柠檬酵素组的IgG含量最高。28日龄时，各浓度柠檬酵素组的IgG含量与空白对照组和阳性对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，24%柠檬酵素组的IgG含量最高。随着时间的推移，麻鸭血清中IgG含量呈升高趋势。

2.2 柠檬酵素对麻鸭血清中IgA含量的影响

在玉米粉中添加柠檬酵素对麻鸭血清中IgA含量影响的测定结果见表2。

表2 柠檬酵素对麻鸭血清中IgA含量的影响Table 2 Effect of lemon enzyme on IgAcontent in the serum of hemp ducks

由表2可知，14日龄时，柠檬酵素组的IgA含量均高于空白对照组和阳性对照组，24%和12%柠檬酵素组IgA含量与空白对照组和阳性对照组相比差异显著(P＜0.05)。21日龄时，柠檬酵素组的IgA含量均高于空白对照组，其中24%柠檬酵素组与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)，柠檬酵素组与阳性对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，不同浓度柠檬酵素组相比差异不显著(P＞0.05)，24%柠檬酵素组的IgA含量最高。28日龄时，柠檬酵素组的IgA含量均高于空白对照组，24%柠檬酵素组与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)，柠檬酵素组与阳性对照组相比差异不显著(P＞0.05)。随着时间的推移，麻鸭血清中IgA含量呈升高趋势。

2.3 柠檬酵素对麻鸭血清中IgM含量的影响

在玉米粉中添加柠檬酵素对麻鸭血清中IgM含量影响的测定结果见表3。由表3可知，14日龄时，各组的IgM含量差异均不显著(P＞0.05)，24%柠檬酵素组的IgM含量高于空白对照组和阳性对照组。21日龄时，各组的IgM含量差异均不显著(P＞0.05)，24%柠檬酵素组IgM含量高于空白对照组。28日龄时，各组的IgM含量差异均不显著(P＞0.05)，柠檬酵素组的IgM含量低于空白对照组和阳性对照组。

表3 柠檬酵素对麻鸭血清中IgM含量的影响Table 3 Effect of lemon enzyme on IgM content in the serum of hemp ducks

2.4 柠檬酵素对麻鸭血清中IL-2含量的影响

在玉米粉中添加柠檬酵素对麻鸭血清中IL-2含量影响的测定结果见表4。

表4 柠檬酵素对麻鸭血清中IL-2含量的影响Table 4 Effect of lemon enzyme on IL-2 content in the serum of hemp ducks

由表4可知，在整个试验期间，柠檬酵素添加组的血清IL-2含量均高于空白对照组。14日龄时，柠檬酵素添加组IL-2含量均高于空白对照组和阳性对照组，但升高不明显(P＞0.05)，24%柠檬酵素组IL-2含量最高。21日龄时，柠檬酵素组IL-2含量均高于空白对照组和阳性对照组，24%柠檬酵素组IL-2含量最高，各组之间差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，柠檬酵素组IL-2含量均高于空白对照组且差异显著(P＜0.05)，与阳性对照组相比差异不显著(P＞0.05)，不同浓度柠檬酵素添加组之间比较差异亦不显著，24%柠檬酵素组IL-2含量最高。

2.5 柠檬酵素对麻鸭血清中IFN-γ含量的影响

在玉米粉中添加柠檬酵素对麻鸭血清中IFN-γ含量影响的测定结果见表5。

表5 柠檬酵素对麻鸭血清中IFN-γ含量的影响Table 5 Effect of lemon enzyme on IFN-γ content in the serum of hemp ducks

由表5可知，14日龄时，柠檬酵素添加组IFN-γ含量均高于空白对照组和阳性对照组，但各组之间差异不显著(P＞0.05)。21日龄时，柠檬酵素添加组IFN-γ含量均高于空白对照组，24%柠檬酵素组和12%柠檬酵素组IFN-γ含量高于阳性对照组，但各组之间差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，柠檬酵素添加组IFN-γ含量均高于空白对照组，但各组IFN-γ含量均在同一水平，差异不显著(P＞0.05)。

3 讨 论

免疫功能是指机体对疾病的抵抗力，机体的免疫功能是在免疫器官、免疫组织和免疫细胞如淋巴细胞、单核细胞和其他有关细胞及其产物的相互作用下完成的[12]。免疫系统由免疫组织、器官、免疫细胞及免疫活性分子等组成。免疫球蛋白是免疫活性分子中的一类，是与抗体分子相似的球蛋白，具有结合抗原、激活补体、结合细胞和调理作用等功能，其中IgG、IgA、IgM是家禽体内三种重要的免疫球蛋白[13]。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒。IgA占血清免疫球蛋白含量的10～20%，血清型IgA可介导调理吞噬ADCC作用。IgM约占血清免疫球蛋白总量的5%～10%，在补体和吞噬细胞参与下，其杀菌、溶菌、激活补体促进吞噬等作用均显著高于IgG，对防止菌血症发生具有重要作用。血清中免疫球蛋白浓度的高低在一定程度上反映了机体对疾病的抵抗能力。研究发现，以酵素饲喂仔猪可提高IgG、IgA、IgM含量，如黄爱霞[14]以和美酵素饲喂断奶仔猪可提高血清中IgA、IgG和IgM的水平。董金格[15]用生物酵素饲喂肉仔鸡，肉仔鸡血清中IgG、IgA、IgM含量均高于空白对照组。胡新旭等人[16]以无抗发酵饲料替代部分基础饲粮(不含抗生素)，断奶仔猪血清IgG含量显著高于对照组(P＜0.05)。张志焱[17]研究表明，在饮水中添加乳酸菌发酵上清液，可显著提高22日龄肉仔鸡血清中IgG的含量。本试验研究结果显示，柠檬酵素对IgM含量无明显影响，但柠檬酵素可显著提高14日龄和21日龄麻鸭血清中IgG含量，24%柠檬酵素在各时间点均可显著提高麻鸭血清中IgA含量，此结果与上述研究结果基本一致，表明麻鸭饲粮中添加柠檬酵素有助于提高其机体的免疫能力。

细胞因子是一类具有调节免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能的小分子蛋白质。其中，IL-2是一种具有广泛生物活性的细胞因子，能有效地提高动物体免疫功能，它必须和受体结合才能发挥生物学效应[18]。IFN是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性[19]。本次试验结果表明，各浓度柠檬酵素均可显著提高28日龄麻鸭血清中IL-2水平(P＜0.05)，并且可在一定程度上提高麻鸭血清中IFN-γ水平。这可能与柠檬酵素中含有的益生菌本身的免疫调节机制有关。谢俊华提出，植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对IL-2具有正调节作用[20]，并有报道称不同乳酸菌介导细胞因子分泌的能力不同[21]。

柠檬酵素能够提高动物的免疫力，其作用机理可能有以下3个方面：一是柠檬酵素中益生菌能促进免疫器官的生长发育及免疫球蛋白含量的增多；二是益生菌可调节细胞因子的分泌从而影响免疫应答；三是柠檬自身的营养价值，益生菌及其产生的氨基酸、维生素、有机酸和醇类等物质可能对麻鸭的血液循环，新陈代谢，造血机能，肠道菌群的改善有所帮助，并加强机体对疾病的抵抗能力从而达到增强免疫力的效果。

本试验研究初步证明，柠檬酵素具有免疫增强作用，但仍存在一些问题：如对柠檬酵素的发酵条件（温度、CO2浓度、基质浓度、pH、发酵时间等）与其作用的关系尚不清楚；不能确定柠檬酵素中有效成分及益生菌含量。另外，本次试验饲喂自制玉米粉，若将柠檬酵素作为饲料添加剂添加在市售饲料中能否在更大程度上发挥作用有待在本试验的基础上进行更加深入、细致的研究。

4 结 论

玉米粉中添加柠檬酵素可显著提高麻鸭血清中IgG和IgA含量，同时，玉米粉中添加柠檬酵素还可显著提高麻鸭血清中IL-2水平。本试验的试验材料柠檬酵素由宜宾高县柠檬基地自主研发，将柠檬与发酵工艺相结合，成本低且操作简便，是一种新型绿色饲料添加剂，为今后的开发应用奠定了基础。