缺氧诱导因子-1α、葡萄糖转运蛋白-1和血管内皮生长因子水平与糖尿病大鼠血糖血脂的相关性

符 杰 冯 俊 张 雨 廖丽娅 胡嫚丽 邓红艳

(华中科技大学同济医学院附属武汉市普爱医院内分泌科，湖北 武汉 430033)

糖尿病视网膜病变是糖尿病发病基础上的高负荷血糖对于动脉血管内皮的长期损伤，视网膜动脉的长期过氧化损伤可以促进局部出血、钙化及黄斑水肿等的形成，进而导致视力的减退和最终致盲，临床预后较差。糖尿病视网膜病变基础病因的探讨中发现，血管内皮生长因子(VEGF)具有重要作用，长期高血糖导致的视网膜损害刺激新生血管生长，新生血管生长可引起视网膜纤维增生，超过15%的患者还可发生视网膜脱离，进而导致急性视力减退〔1，2〕。相关研究也证实，早期通过抑制VEGF能够有效降低疾病的进展率，并能够在病理水平改善出血斑点、硬性渗出等〔3，4〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α、葡萄糖转运蛋白(Glut)-1能够诱导缺氧状态，并改变局部视网膜血管内皮细胞的代谢环境，进而促进VEGF上调，促进视网膜病变发展〔5，6〕。本研究探讨 HIF-1α、Glut-1和VEGF与糖尿病大鼠血糖血脂的相关性。

1 材料和方法

1.1分组 雄性SD大鼠30只，体重190～210 g，平均体重(193.2±2.3)g，精心饲养3 d，随机分为实验组20只和对照组10只。大鼠均在相同条件下饲养，购自江苏省动物实验中心。

1.2实验试剂 链脲佐菌素(STZ)购自南京凯基生物科技有限公司，HIF-1α、Glut-1一抗体(兔来源，均购自罗氏检测公司)，VEGF抗体(羊来源，购自美国Abcum公司)，二氨基联苯胺(DAB)检测试剂盒购自上海精密仪器有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗购自南京碧云天生物科技有限公司。

1.3糖尿病大鼠建模 实验组于实验前禁食24 h，腹腔注射4%水合氯醛280 μl/kg麻醉，固定在动物手术台，腹腔注射50 mg/kg STZ。所有大鼠单笼喂养，定量饮水与普通喂食饲养2 w。血糖水平>11.1 mol/L，体重明显降低，提示糖尿病大鼠制备成功。

1.4免疫组化染色法检测视网膜HIF-1α、Glut-1和VEGF的表达 10 g/L戊巴比妥钠腹腔内注射，采用0.5 mol/L的多聚甲醛灌流固定，石蜡切片，多聚赖氨酸处理。将切片置于60℃恒温箱烘烤1 h，用二甲苯连续两次浸泡10 min，水化后修复抗原，3%H2O2-甲醇溶液处理15 min，加HIF-1α、Glut-1和VEGF鼠单抗100 μl，37℃孵育1.0 h，加增强剂50 μl，室温孵育20 min，加HRP标记二抗50 μl，室温孵育30 min，DAB显色，镜下观察。

1.5观察指标及检测方法 对比两组视网膜组织细胞免疫组化染色结果，判定标准，细胞内棕色或棕黄色颗粒则为蛋白阳性反应，HIF-1α蛋白主要在胞质和胞核表达，VEGF和Glut-1蛋白主要在胞质表达。染色强度+阳性细胞率评分，包括阴性：0分；弱阳性：1分；中度：2分；强阳性：3分。阳性细胞率分级包括0分：≤5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。染色强度×阳性细胞率评分≥1分，判定为蛋白阳性表达。检测两组三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Cr)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血红蛋白(Hb)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹血胰岛素(FINS)、稳态模式评估法测定胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。门静脉采血5 ml 3 000 r/min离心15 min，取上清液冷冻保存待测，将血清置于Eppendorf 管中，-80℃超低温冰箱保存，采用全自动生化仪成批检测血糖和血脂水平。试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行t检验，相关性分析采用Spearman检验。

2 结 果

2.1两组视网膜HIF-1α、Glut-1和VEGF表达 两组视网膜组织内均有HIF-1α、Glut-1和VEGF的表达，见图1。实验组HIF-1α、Glut-1和VEGF的表达水平显著高于对照组(P<0.01)，见表1。

图1 两组HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白在视网膜组织中表达(DAB,×400)

组别nHIF-1α (pg/ml)Glut-1(pg/ml)VEGF(pg/ml)实验组20752.4±368.0479.4±221.349.3±15.9对照组10594.0±177.9268.8±120.727.0±14.1t值9.8579.74210.202P值0.007 50.008 20.004 8

2.2两组血清相关指标比较 两组TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG、FINS、HbA1c和HOMA-IR检测值差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3HIF-1α、Glut-1和VEGF与糖尿病大鼠血糖血脂的相关性 糖尿病大鼠视网膜组织内HIF-1α、Glut-1与血脂血糖指标呈正相关(除与HDL-C呈负相关)(均P<0.05)，VEGF与血脂和血糖(除HbA1c、FINS外)呈正相关(P<0.05)，与HDL-C呈负相关(P<0.05)，见表3。

表2 两组血糖和血脂指标对比

表3 HIF-1α、Glut-1和VEGF与糖尿病大鼠血糖血脂的相关性

3 讨 论

视网膜病变是具有特异性改变的眼底病变，为糖尿病性微血管病变中最集中的体现。主要病理改变为动脉瘤、出血斑点、硬性渗出、棉绒斑、静脉串珠状及继发性视网膜剥脱等。在糖尿病导致的局部动脉血管的高血糖环境中，血管内皮细胞的氧化应激及三磷酸腺苷(ATP)能量利用障碍更为明显，局部视网膜基底膜长期处于缺氧状态，在白细胞介素(IL)-6及IL-8等炎症因子的诱导下可反馈性促进VEGF的生成〔7，8〕，扰乱内皮细胞功能，促进视网膜细胞缺血缺氧，导致视网膜发生水肿、渗出及增生等病理改变。新生毛细血管的供血功能明显减弱，同时新生血管分布较乱，常常侵犯玻璃体，导致局部渗漏和玻璃体剥离出血。 朱丽等〔9，10〕实验证实，在抑制VEGF的基础上，重度视网膜病变的发生率可下降15%左右，且疾病进展率可下降20%，具有明显的效果，这些均提示了VEGF在糖尿病视网膜病变发展中的作用。HIF-1α具有转录活性的核蛋白，在缺氧适应、炎症发展等方面发挥了重要作用，其可以通过刺激末端缺氧信号的活性调控区域(富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸)，进而促进局部细胞代谢的低氧和应激基础〔11，12〕；Glut-1可以介导葡萄糖的易化扩散进而转运葡萄糖进入血-视网膜屏障内皮细胞，相关研究证实随着视网膜病变的进展，Glut-1表达也明显增加，特别是高表达的Glut-1可以导致转运进入内皮细胞中的葡萄糖浓度增加，从而导致视网膜破坏〔13〕。

TG、TC和LDL-C等血脂指标是糖尿病发生发展的独立危险因素，本研究表明糖尿病大鼠体内存在明显的血脂代谢紊乱，长期的血脂紊乱可以进一步促进糖尿病视网膜病变的发展，增加视网膜病变基础上的视盘新生血管、视网膜前出血及牵拉性视网膜脱离等的发生率。VEGF上调可以促进新生血管的形成及局部视网膜基底层的纤维化，视网膜间质成分代偿性增生，同时VEGF可进一步促进新生血管对于玻璃体的侵袭，进一步导致玻璃体出血和增殖性视网膜病变的发生。而HIF-1α和Glut-1上调可能在这一过程中起到了重要促进作用，Glut-1上调导致的经过血-视网膜内皮细胞的葡萄糖浓度明显增加，而机体又缺乏有效的代偿机制，从而促进视网膜血管内皮的损伤。Ulas等〔14，15〕认为，HIF-1α和Glut-1可以通过影响局部能量代谢、增强局部缺氧环境，进而促进VEGF上调，并通过糖尿病大鼠造模实验证实，HIF-1α和Glut-1水平平均上升15%和25%，这与本次研究结论较为相似。