右美托咪定对脑缺血再灌注损伤大鼠神经的保护作用及机制

邢 娜 李平乐 张建文 邢利卡 张 卫

(郑州大学第一附属医院麻醉科，河南 郑州 450052)

右美托咪定(DEX)属于α2肾上腺素受体激动剂，广泛应用于外科手术麻醉〔1〕。近年来发现，DEX还具有神经保护功能〔2〕，然而其内在作用机制尚未被完全阐明。免疫炎症应答在神经保护中发挥重要作用，有研究发现〔3〕，DEX能够通过激活α2肾上腺素受体信号通路发挥抗炎作用，减少炎症细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β等。Toll样受体(TLRs)在体内广泛存在，是炎症信号传递的门户蛋白，与相应的配体(如多种致病原)结合后，促进炎症介质的释放〔4〕。TLR-4是TLRs家族成员之一，在脑缺血过程中被激活，进而引发一系列炎症级联反应〔5〕；此外，TLR-4还能够激活核因子(NF)-κB信号通路，进一步启动多种炎症因子的基因转录翻译。已有研究证实，在肝脏、肺等多种器官发生缺血过程中，DEX能够抑制TLR-4介导的炎症反应，减轻再灌注损伤〔6，7〕。然而，在脑缺血过程中，DEX能否减轻再灌注损伤，目前的报道尚少。本研究旨在探讨DEX在脑缺血再灌注(CIR)损伤中是否发挥神经保护作用，并且是否与TLR-4/NF-κB信号通路有关，为CIR损伤相关研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1动物模型的构建和实验分组 雄性SD大鼠40只，体重250～300 g，周龄12～16 w，购于河南省实验动物中心，合格证号：SYXK(豫)2016-0002。本研究经医院动物伦理委员会审核批准，实验过程遵守《实验动物管理条例》。

大鼠适应性饲养1 w，随机分为假手术组、模型组、DEX组(100 μg/kg DEX，腹腔注射，术前30 min)、瑞沙托维(RES，3 mg/kg RES，腹腔注射，术前30 min)组，每组10只。各组大鼠周龄、体重差异无统计学意义(均P>0.05)。

采用大脑中动脉闭塞(MCAO)法进行CIR大鼠模型诱导〔8〕：术前所有大鼠禁食12～16 h，在此期间自由饮水，手术开始前所有大鼠进行称重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g，腹腔注射)麻醉，仰卧位固定于手术台上，让大鼠的颈部充分暴露，行常规消毒，在大鼠颈正中切口，切开长度2.0 cm左右，逐层分离，让左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)充分暴露，微血管动脉夹暂时夹闭CCA和ICA，于ECA做V形切口，将制备好的线栓插入，去除ICA的微动脉夹，将线从ECA插入，进入ICA颅内段，进入长度约距CAA分叉处(12.0±0.5)mm，当进线遇轻微阻力，栓线正好堵住大脑中动脉的开口。线栓堵住左侧大脑中动脉的开口，阻断60 min后，拔出线栓，扎紧动脉残端，缝合伤口，完成CIR模型诱导。假手术组只分离血管，不结扎血管，不置入线栓。

1.2神经功能评分 神经症状评分采用单盲法。CIR术后2 h及24 h后，采用Longa神经功能评分法〔9〕进行神经功能评分，评分标准：无神经损伤症状(0分)；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直(1分)；行走时向瘫痪侧转圈(2分)；行走时向病灶对侧跌倒(3分)；不能自发行走，意识丧失(4分)。评分为0分及4分，视为造模不成功。最终，模型组、DEX组和RES组各有8只CIR大鼠，假手术组有10只大鼠。

1.3脑组织氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 CIR术后24 h，每组随机取4只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，随后采用0.9%氯化钠溶液250 ml经左心室灌流，迅速断头取脑，迅速置于液氮中冷冻10 min，去除嗅脑和脑干，自视交叉处向后连续做4个冠状位切片，厚约2 mm。脑片浸入2% TTC溶液，37℃恒温水浴中孵育15 min染色，染色后取出，于4%多聚甲醛中固定24 h后，观察脑组织梗死情况(红色区域为正常脑组织，苍白色区域为梗死区)，采用Motic Med 6.0 System计算脑梗死体积。

1.4TUNEL染色 CIR术后24 h，每组剩余大鼠经腹腔注射10%水合氯醛，0.9%氯化钠溶液250 ml经左心室灌流，然后迅速断头取脑，迅速置于液氮中冷冻10 min，将脑横切为2部分，一部分用TUNEL染色，另一部分用于Western印迹实验(液氮保存)。

4%中性甲醛固定脑组织，常规脱水石蜡包埋，切片，采用TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)进行组织染色，操作步骤严格参照试剂盒说明书。TUNEL染色阳性细胞呈棕黄色，圆形或椭圆形，细胞核呈固缩状态，偶见核碎裂。高倍显微镜(×200，BX41，日本OLYMPUS公司)下，各切片取5个互不重叠的视野，对各组大鼠海马CA1区的凋亡细胞(TUNEL染色阳性细胞)和正常细胞(TUNEL染色阴性细胞)进行计数，计算凋亡细胞占总细胞数的百分比。

1.5Western印迹实验 取出液氮保存的脑组织，匀浆后，一部分用于总蛋白的提取，用于检测TLR-4、p-IκB和GAPDH蛋白表达(RIPA裂解液，上海碧云天生物技术有限公司)，另一部分用于核蛋白的提取，用于检测NF-κB p65和组蛋白H3蛋白表达(核蛋白提取试剂盒，美国Thermo公司)，BCA试剂盒(美国Thermo公司)检测总蛋白及核蛋白浓度。

10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，TBS-T洗膜，羊抗大鼠单克隆抗体TLR-4(美国Santa公司)，羊抗大鼠单克隆抗体NF-κB p65(美国Santa公司)，羊抗大鼠单克隆抗体p-IκB(美国Santa公司)，总蛋白内参GAPDH抗体(美国Santa公司)，核蛋白内参组蛋白H3抗体(美国Santa公司)，4℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊二抗(北京博奥森生物技术公司)，室温孵育1 h，TBS-T洗膜后，加ECL发光液(美国Millipore公司)，凝胶成像仪(ChemiDoc-It 510，美国UVP公司)进行化学发光显影，检测各蛋白的显影条带，并对蛋白显影条带进行灰度分析(Image Lab软件)，计算目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值，进行统计分析。

2 结 果

2.1DEX明显改善神经功能缺损 单因素方差分析显示，术后2 h及24 h的神经功能评分四组间整体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较：CIR术后2 h，假手术组神经功能表现正常，而模型组、DEX组及RES组均出现了明显的神经功能缺损症状(t=2.885，P=0.012；t=2.398，P=0.031；t=2.739，P=0.016)，提示CIR大鼠模型建立成功。CIR术后24 h，DEX组与模型组相比，神经功能显著改善(t=2.433，P=0.029)，与RES之间差异无统计学意义(t=1.874，P=0.082)，表明DEX治疗与RES治疗一样，均能够改善CIR损伤导致的神经功能缺损症状，从而起到神经保护作用。见表1。

表1 各组大鼠CIR术后2 h及24 h的神经功能评分分)

2.2DEX明显减少脑梗死 CIR术后24 h，TTC染色法直接观察DEX对大鼠脑梗死区域的影响，梗死区域主要位于额顶叶皮质和尾壳核，TTC染色为白色；正常组织TTC染色为红色，部分组织可见白色向红色过渡，为半暗区。假手术组没有明显白色梗死区域，模型组可见明显较大范围的白色梗死区域，DEX组和RES组的白色梗死范围均显著小于模型组。见图1。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色比较

采用Motic Med 6.0 System计算脑梗死体积百分比，经方差分析，四组间整体差异有统计学意义(F=7.291，P=0.007)。两两比较并结合主要数据分析：DEX组脑梗死体积〔(25.39±5.18)%〕显著低于模型组〔(34.85±6.82)%，t=4.199，P=0.003〕，而与RES组〔(27.63±4.91)%〕之间差异无统计学意义(t=1.965，P=0.085)。

CIR术后24 h，TUNEL染色结果显示，假手术组无TUNEL染色阳性细胞，而模型组、DEX组和RES组的大脑海马CA1区均可见大量TUNEL染色阳性的凋亡细胞。见图2。

图2 各组大鼠CIR术后24 h海马CA1区TUNEL染色比较(×200)

统计结果显示：凋亡细胞比例的四组间整体比较(单因素方差分析)差异有统计学意义(F=9.285，P<0.05)，两两比较并结合主要数据分析：DEX组凋亡细胞比例〔(31.38±3.27)%〕明显低于模型组〔(43.94±5.27)%;t=2.702，P=0.027〕，而与RES组〔(29.71±3.12)%〕相比差异无统计学意义(t=1.763，P=0.116)。

2.3DEX可抑制脑组织TLR-4/NF-κB信号通路活性 CIR术后24 h，方差分析显示整体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据分析：与模型组相比，DEX组大鼠脑组织中大鼠脑组织TLR-4、p65、p-IκB蛋白表达水平均显著降低(t=3.806，P=0.019；t=3.588，P=0.023；t=2.949，P=0.042)，而与RES组之间差异无统计学意义(t=2.570，P=0.062；t=2.720，P=0.053；t=2.097，P=0.104)。见表2和图3。

图3 各组大鼠CIR术后24 h，脑组织TLR-4、p65、p-IκB蛋白的Western印迹曝光图

组别TLR-4p65p-IκB假手术组1.03±0.130.97±0.180.97±0.21模型组3.651±0.923.21±0.832.43±0.87DEX组1.95±0.292.61±0.821.52±0.72RES组2.13±0.352.31±1.221.39±0.92F值11.29317.23610.376P值0.0000.0000.000

3 讨 论

CIR损伤是由脑组织缺血、恢复血流再灌注后引发的脑组织及神经细胞损害加重的现象。CIR损伤是多因素共同作用的结果，其发生机制复杂〔10〕，炎症是导致CIR损伤的病理机制之一〔11，12〕。TLRs是参与急性炎症反应与天然免疫应答的主要物质，多种致病原、细胞因子及环境压力均能够诱导TLRs快速激活〔13〕。TLRs家族成员分布在不同的组织器官，其中TLR-4参与调节大脑对外界压力的应答，TLR-4参与了CIR损伤中的大脑损伤和炎症反应。有研究结果表明，在CIR损伤后，小神经胶质细胞，神经元和星形细胞中TLR-4的表达水平显著增加〔14〕。NF-κB信号通路在TLR-4介导的炎症反应中占重要地位，TLR-4可在脑缺血后识别脑组织细胞释放的热休克蛋白、透明质酸等内源性物质，导致自身发生二聚化，进而逐步激活NF-κB。NF-κB在如炎症反应、细胞凋亡等多种生理病理过程发挥作用，是一种重要的核转录因子。在正常细胞中，NF-κB与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合，以无活性形式存在于细胞质。当细胞被外界剌激时，经TLR-4信号转导后，激活IκB激酶(IKK)，导致IκB被磷酸化(即p-IκB)、泛素化后降解。这使得被IκB抑制的NF-κB游离释放，NF-κB p65由细胞质进入细胞核，发挥生物学效应。本研究表明在CIR损伤的病理生理过程中TLR-4/NF-κB信号通路激活发挥着重要的作用。已有多种TLR-4抑制剂被证实能够降低CIR损伤。在多种动物模型中发现，TLR-4特异性抑制剂-RES能够通过调节与TLR-4/NF-κB信号通路相关的炎症反应，发挥神经细胞保护的作用〔7〕。银杏苦内酯B和孕酮作为TLR-4非特异性抑制剂，也能够通过抑制TLR-4信号通路对神经细胞起保护作用，同时减轻炎症反应〔15〕。本研究结果也显示，接受RES预处理的RES组大鼠脑组织中TLR-4/NF-κB信号通路活性明显低于模型组大鼠，且神经功能缺损症状也得到显著改善，证实在大鼠CIR损伤过程中，RES确实能够通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路活性发挥神经保护作用，在本研究中，RES组作为阳性对照组。 DEX能够通过抑制炎症反应，发挥神经保护作用。有研究结果表明，DEX能够通过降低TLR-4/NF-κB信号通路活性发挥抗炎作用，从而对肾脏和肺具有保护作用〔16〕。也有研究结果表明，DEX可能通过其他途径发挥神经保护作用，如减少钙离子内流，发挥抗氧化作用，抑制兴奋性神经递质，抗凋亡等〔17〕。综上所述，DEX可以减轻CIR大鼠的再灌注损伤，其机制可能是通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路上的关键信号分子TLR-4、NF-κB p65、p-IκB的蛋白表达，抑制TLR-4/NF-κB信号通路活性，从而减轻CIR过程中的炎症反应，减小脑梗死体积，让神经功能缺损情况得到改善，起到神经保护作用。但TLR-4/NF-κB信号通路对CIR中神经细胞凋亡的调控是一个多方向、多途径的过程，因此，仍需要大量的后续实验对其作用及其机制记忆补充和全面阐释。