甜菜碱联合藻蓝蛋白对肺癌细胞A549体内外增殖的影响

王碧荣 李卫东 邓旭斌 方盛华 王 慧

(广州医科大学附属肿瘤医院胸部肿瘤内科，广东 广州 510095)

肺癌发病率和死亡率都逐年升高，尤其是晚期肺癌，治疗手段以化疗及靶向治疗为主，而目前化疗药物疗效出现瓶颈，寻找新的化疗药物是晚期肺癌治疗的热点〔1〕。化疗药物大部分由天然植物提炼或者天然植物成分合成，因此天然植物为化疗药物做出了极大的贡献〔2〕。藻蓝蛋白是一种无副作用的天然植物营养物质，已经被广泛添加到食品中。有相关研究显示，藻蓝蛋白可以抑制体内和体外癌细胞的增殖〔3，4〕。而之前也有报道指出甜菜碱也具有抗肿瘤的效果，并且这种抗肿瘤的作用可能是通过调节基因表达和稳定癌症抑制基因的甲基化所介导的〔5〕。由于甜菜碱与藻蓝蛋白均有无毒及抗癌作用，是否可成为新的化疗药物是当前研究焦点。关于甜菜碱和藻蓝蛋白对于人肺癌细胞A549细胞周期和增殖影响的研究甚少。本研究旨在探索甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独以及联合使用对肺癌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1实验试剂 甜菜碱(≥99%)，藻蓝蛋白(≥95%)(Sigma，美国)，胎牛血清(Hyclone 公司，美国)，RPMI1640 培养液(Gibco 公司，美国)，MTT试剂盒，蛋白提取试剂盒(Invitrogen 公司，美国)，兔抗人MAPK抗体和兔抗人β-actin抗体(Abcam，美国)。

1.2细胞株 人肺癌细胞株 A549 细胞购于中国科学院上海细胞库。

1.3实验动物 裸鼠〔许可证号：SCXK(粤)2013-0008〕40只，体重18～22 g，购于广东医科大学，于无菌培养室内饲养。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养 A549细胞培养于10%胎牛血清+1%抗生素的 1640培养液中，培养条件为5% CO2，相对湿度95%，37℃培养箱中培养。

1.4.2荷瘤裸鼠模型 无菌环境中定期喂食裸鼠灭菌好的鼠粮和水1 w后，酒精消毒裸鼠背部皮肤，开始接种制备好的A549细胞悬液(1×106/200 μl)用1 ml注射器接种于裸鼠右侧背部皮下，制成人肺癌裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型成功后(注射点无破溃红肿，皮下结节直径>0.5 cm为成瘤标准)，将裸鼠随机分成4组(对照组，甜菜碱组，藻蓝蛋白组，甜菜碱+藻蓝蛋白组)，每组10只。无菌环境中饲养，游标卡尺测量肿瘤体积(TV)，30～50 mm3时开始给裸鼠喂药，甜菜碱组裸鼠每次给10%甜菜碱0.2 ml。藻蓝蛋白组每次给药0.2 ml，剂量为100 μg/L，联合组给10%甜菜碱+100 μg/L藻蓝蛋白；对照组每天每次注射0.2 ml 生理盐水，连续给药3 w，1次/d，均采用腹腔注射，给药后正常喂鼠粮和水。每周测量一次实体瘤的大小，并记录结果。TV=0.5×长径×(短径)2。

1.4.3MTT实验 取对数生长期A549细胞，每孔2×103/100 μl细胞接种于96孔板培养24 h，每孔加入不同浓度甜菜碱(0.01%、0.10%、1.00%和4.00%)或藻蓝蛋白(10、20、30和40 μg/L)或对应的联合作用组合；在37℃，5%CO2条件下培养48 h。细胞在处理完毕之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，继续培养4 h，吸出培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl 充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶标仪(Bio-Tek，ELX800)在波长490 nm处读取吸光度(A490)值。增殖效率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。

1.4.4Western印迹试验 A549细胞5×105/孔接种于6孔板中，待细胞长至90%左右时，分别加入4%甜菜碱，40 μg/L藻蓝蛋白和4%甜菜碱+40 μg/L藻蓝蛋白，对照组加入无血清1640培养液，分别培养24 h和48 h提取细胞蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定每组蛋白质浓度，每孔总蛋白上样量为30 μg，上完样后进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后转膜(120 V，90 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗涤缓冲液洗膜5 min/次，洗5次。分别加入MAPK抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶2 000)4℃孵育过夜，洗涤缓冲液洗膜5 min/次，洗5次。分别用稀释比例为1∶1 000的羊抗兔二抗37℃摇床反应1 h，洗涤缓冲液洗膜5 min/次，洗5次。用电化学发光(ECL)试剂盒进行显色后凝胶成像分析系统(中国，Tanon 5200)拍照后采用LabWorks4.6软件进行灰度值分析。

1.4.5流式细胞术检测细胞周期 A549细胞5×105/孔接种于6孔版中，待细胞长至90%左右时分别加入4%甜菜碱，40 μg/L藻蓝蛋白和4%甜菜碱+40 μg/L藻蓝蛋白，对照组加入无血清1640培养液，培养48 h用胰酶消化收集细胞1×105，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，弃上清，加入1 ml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12 h，PBS洗涤去乙醇，离心5 min(2 500 r/min)，洗2次。0.5 ml PBS重悬细胞，加入碘化锭(PI)和 RNaseA至终浓度50 μg/ml，37℃温浴30 min。用流式细胞仪(BD Influx)上机测定细胞周期。

1.5统计学分析 应用SPSS18.0软件，计量资料比较采用单因素方差分析、HSD-q检验，两因素析因方差分析、LSD-t检验，重复测量资料则行重复测量方差分析、组间LSD-t检验、时间差值t检验。

2 结 果

2.1MTT检测甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独和联合对肺癌细胞A549活性 随着甜菜碱浓度的增加，肺癌细胞A549活性出现先增加后降低的趋势，与对照组(0)相比，甜菜碱的浓度为0.01%和0.10%时A549细胞的活性显著增加，而4%的甜菜碱时A549细胞的活性显著降低(均P<0.05)。藻蓝蛋白作用A549细胞时，细胞的活性并没有发生太大的变化，仅当藻蓝蛋白浓度增加到最高浓度时，细胞的活性相比对照组才出现明显下降(P<0.05)。二者联合使用(A：甜菜碱，B：藻蓝蛋白)时细胞活性降低(AB交互作用P<0.05)。当甜菜碱的浓度为4%时，无论是单独作用还是和藻蓝蛋白联合使用，细胞的活性亦有明显降低(P<0.05)。见表1、表2。

2.2流式细胞仪检测甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独和联合对肺癌细胞A549周期 甜菜碱组、藻蓝蛋白组及两者联合组在G2/M期出现明显细胞受阻，甜菜碱组处于G2/M期的比例为50.73%，藻蓝蛋白组为17.39%，甜菜碱与藻蓝蛋白联合组为58.19%，均高于对照组的7.98%(P<0.05)。表明甜菜碱和藻蓝蛋白联合使用将A549细胞周期阻滞在G2/M期，抑制细胞增殖。见表3。

表1 甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独对肺癌细胞A549活性的影响

1)2)3)4)分别为与A、B、C、D组比较：P<0.05

表2 甜菜碱和藻蓝蛋白二者联合对肺癌细胞A549活性的影响

表3 甜菜碱、藻蓝蛋白二者单独和联合对肺癌细胞A549周期的影响(%,n=6)

与对照组比较：1)P<0.05

2.3Western印迹法检测甜菜碱和藻蓝蛋白对肺癌细胞A549内MAPK蛋白的表达 甜菜碱和藻蓝蛋白分别和联合作用A549细胞24 h，A549细胞内MAPK蛋白水平表达均有明显升高(P<0.05)，而48 h MAPK蛋白水平更加显著，其中甜菜碱和藻蓝蛋白联合作用A549细胞时，MAPK蛋白水平表达显著升高(P<0.05)(见表4)。这表明甜菜碱和藻蓝蛋白均能促进肺癌细胞株MAPK蛋白表达，从而抑制细胞株增殖。

2.4甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独和联合对肺癌细胞A549荷瘤鼠TV的影响 荷瘤鼠分别喂食甜菜碱和藻蓝蛋白后，TV与对照组比较呈减小趋势，同时喂食

甜菜碱和藻蓝蛋白后与二者单独作用相比，TV更趋减小。2 w时，单独喂食甜菜碱和藻蓝蛋白组，二者联合喂食组与对照组相比，TV均明显减小(P<0.05)。3 w时，单独喂食甜菜碱和藻蓝蛋白组，二者联合喂食组与对照组相比，TV亦分别减小(P<0.05)。提示甜菜碱和藻蓝蛋白二者联合使用的杀瘤效果要强于单独使用。见表5。

表4 甜菜碱和藻蓝蛋白对肺癌细胞A549内MAPK蛋白表达的影响

1)2)3)分别为与A、B、C组相比：P<0.05；4)为与24 h比较：P<0.05

表5 甜菜碱和藻蓝蛋白对肺癌细胞A549荷瘤鼠TV的影响

1)2)3)分别为与A、B、C组相比：P<0.05；4)为与0 w时比较：P<0.05

3 讨 论

肺癌的发生发展与抑癌基因甲基化关系密切，稳定抑癌基因的甲基化对抑制肿瘤的发生有重要意义。甜菜碱是一种高效的甲基提供者，它对于稳定DNA甲基化的过程具有重要作用。甜菜碱广泛存在于多种天然植物及食品中〔6〕，而体内的胆碱也可通过肝脏和肾脏氧化成甜菜碱〔7〕。同时甜菜碱细胞膜结构的完整性和信号功能，神经传导素的合成中起到重要作用。因此，目前甜菜碱被应用于治疗心脑血管、神经系统及内分泌系统疾病。而在恶性肿瘤中研究表明，甜菜碱能抑制白血病细胞株、肉瘤细胞株、乳腺癌细胞，结肠腺癌细胞，经研究发现其通过调节基因表达和抑癌基因的甲基化来抑制癌细胞的增殖〔8～11〕。在肝癌研究中，Zhou等〔6〕发现甜菜碱联合胆碱可降低原发性肝癌的发生风险。在肺癌的研究中，也发现甜菜碱可降低其发生风险〔12〕，但目前对甜菜碱降低肺癌发生的机制未明确。藻蓝蛋是藻胆蛋白家族成员之一，具有光能作用。藻胆蛋白由于其富含丰富的脂肪，维他命，微量金属，叶绿素，β-胡萝卜素和多糖等组分，因此是一种重要的天然植物〔13〕。有研究表明，藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗病毒，免疫刺激等多种生物学功能〔14〕。而在抗肿瘤中，Yang等〔15〕研究发现，藻蓝蛋白可以抑制体外宫颈癌HeLa细胞和肺癌细胞株A459的增殖，其作用机制可能与抑制细胞周期、促进细胞凋亡及介导细胞溶解有关。

综上所述，甜菜碱与藻蓝蛋白均有抑制肿瘤细胞增殖作用，而两者联合作用，是否有更显著的抑瘤作用，目前国内外研究甚少。

本研究结果显示，甜菜碱可以有效降低肺癌细胞A549的存活率，而且随着浓度的升高，抑制肺癌细胞株增殖越明显，这结果与Guo等〔16〕报道的不同浓度甜菜碱处理Hela和HepG2细胞实验结果相似。而在藻蓝蛋白抑制实验中，发现随着浓度的升高，抑制肺癌细胞增殖也有所增强，但总体上藻蓝蛋白抑瘤作用不是非常明显，这与张成等〔17〕研究藻蓝蛋白在人结肠癌SW480细胞增殖的结果存在差异。当藻蓝蛋白与甜菜碱联合时，可明显抑制了肺癌A459细胞株的生长，抑制效果比单独使用甜菜碱或者藻蓝蛋白均强，这结果与Yang等〔15〕的研究比较相似。其中一种原因可能是由于藻蓝蛋白的来源不同，导致实验结果也不同，另一种因素可能与藻蓝蛋白光能作用起到协同其他药物促进细胞凋亡相关。诱导细胞凋亡主要是通过两种不同的细胞内通路引起，分别由死亡受体和线粒体的激活所介导，其中线粒体的介导激活与药物或者放射治疗有关，作用机制可能是药物可激活细胞内的p38 MAPK的表达，p38 MAPK可激活线粒体的介导细胞凋亡功能，这表明它激活是药物引起细胞凋亡的必要过程〔18〕。本实验结果提示甜菜碱和藻蓝蛋白有促进细胞内p38 MAPK蛋白的表达，从而激活线粒体功能抑制肺癌A459细胞株增殖，而且两者联合并且作用时间越长，表达含量越高，可能抑制肺癌细胞株增殖的功能越强。细胞周期中G1期是细胞增殖复制的起点，而G2/M期是细胞进入有丝分裂的关键点，这两个时点受到抑制均可导致细胞周期复制阻塞，导致细胞凋亡，因此细胞周期的功能失调对于癌症的发生发展具有重要的作用，特别是对G1和G2/M期的调控，将成为恶性肿瘤治疗的热点。在本研究中，甜菜碱与藻蓝蛋白均可导致肺癌细胞株A459细胞周期在G1期出现细胞比例下降，而在G2/M期出现细胞堆积，这表明两者均能抑制肺癌细胞进入G1复制期和G2/M有丝分裂期，导致细胞凋亡，其中甜菜碱作用效果更加明显，而且与浓度呈正相关。与单独用甜菜碱组相比，联合藻蓝蛋白组中，G1期的细胞数量，而G2/M期细胞数量增多。这表明甜菜碱联合藻蓝蛋白调控肺癌细胞株作用更加显著。本研究发现甜菜碱和藻蓝蛋白具有抑制肺癌细胞活性，抑制细胞周期增殖的作用，而两者联合使用时，抑制作用更加显著，藻蓝蛋白可能有协同甜菜碱作用。

体内实验结果与Kim等〔19〕在结肠癌肿瘤鼠模型中结果相似，表明甜菜碱可以明显抑制ROS的产生并且降低氧化型谷胱甘肽的浓度，从而起到抗氧化作用而抑制肿瘤生长。藻蓝蛋白作为富含半胱氨酸/甲硫氨酸的蛋白质可以通过调节pH来影响甜菜碱的吸收，而且可以通过激活线粒体功能诱导细胞凋亡，杀伤肿瘤细胞，因此，甜菜碱与藻蓝蛋白在体内研究中也存在着协同作用。本研究结果显示：甜菜碱与藻蓝蛋白在体内也可以抑制肺癌细胞增殖，导致肿瘤缩小。

综上所述，藻蓝蛋白和甜菜碱在体内外均能抑制肺癌细胞增殖，而且两者联合时作用更加明显，该结果虽然未能完全阐明两者联合对肺癌细胞的作用机制，但为探索甜菜碱和藻蓝蛋白是否能成为新的抗肿瘤药物提供了实验基础。