老年抑郁症患者芳香烃受体核转移蛋白和神经元PAS结构域蛋白表达与认知功能的关系

张 颖 李 洁 李 刚 李 涛 梁海翔

(天津医科大学研究生院，天津 300074)

老年抑郁症是一组异质性疾病，通常伴有认知功能障碍。脑卒中后抑郁占老年抑郁症患者的30%～40%〔1〕，是引发抑郁症的主要病理因素之一。持续的抑郁状态可引发认知功能障碍，导致患者日常生活不能自理，给家庭和社会带来沉重负担。海马组织是边缘系统的重要组成，也是学习、情感等高级认知的重要解剖学基础〔2〕。动物实验显示，孤氧并行为限制的大鼠海马组织中芳香烃受体核转移蛋白(Arnt)2表达明显上调、神经元PAS结构域蛋白(Npas)4表达明显下调〔3〕，提示Arnt2和Npas4可能通过改变海马功能进而对认知功能产生影响。本研究分析Arnt2、Npas4对老年抑郁症患者认知功能的影响机制。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2015年6月至2016年10月天津市安定医院老年科、神经内科、精神科住院的老年患者共173例。筛选标准：①既往无心肺衰竭、癌症等严重疾病；②既往无精神类疾病史，神志清晰，能够配合本次研究；③经患者本人或其家属知情同意。使用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)-24评定患者精神情况：≤20分为无抑郁，21～35分为抑郁，>35分为严重抑郁。本研究依据HAMD-24量表评分结合患者脑卒中病史进行分组：有脑卒中病史且评分>20分为脑卒中后抑郁组(47例)；无脑卒中病史且评分>20分为原发性抑郁组(52例)；有脑卒中病史且评分≤20分为脑卒中组(45例)；无脑卒中病史且评分≤20分为对照组(29例)。

1.2主要试剂 Trizol试剂盒、TIAN Script cDNA合成试剂盒购于上海索宝生物科技有限公司；RIPA裂解液购于无锡柏欧美地生物科技有限公司；鼠抗人Arnt2单抗隆抗体、兔抗人Npas4单抗隆抗体、GAPDH抗体购于上海康朗生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1认知功能评价 脑卒中后抑郁组、原发性抑郁组、脑卒中组患者分别于入院1 w内和2 w后进行认知功能评价。使用日本光电MEB-9200K肌电图诱发电位仪测定，具体方法为：患者取卧位，放松全身肌肉，直视前方注意力集中，采用靶刺激和非靶刺激。其中非靶刺激规律出现，靶刺激随机出现，患者对靶刺激进行按键反应，设备记录命中率及反应时间，重复3次取均值。以对照组为参照，观察P300的波幅及潜伏期，异常标准为超出对照组2.5个标准差。

1.3.2标本采集与处理 入选患者分别抽取空腹外周静脉血5 ml，抗凝处理后2 000 r/min离心20 min，最上层为血浆，中间层为白细胞，下层为红细胞。使用无菌吸管分离血浆层和白细胞层并分装到不同离心管中，血浆放于-80℃冻存，白细胞用于提取RNA检测mRNA和蛋白表达情况。

1.3.3荧光定量PCR检测Arnt2、Npas4 mRNA表达情况 Trizol试剂盒提取白细胞中的总RNA，紫外分光光度法检测浓度并计算含量，取其中5 μg逆转录合成cDNA。Arnt2、Npas4引物由北京创博环球生物科技有限公司设计并合成。反应体系共20 μl：cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、Sybr荧光染料7 μl、双蒸馏水9 μl。反应条件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 10 s、72℃ 20 s，共40个循环。分析各条带荧光强度，以Ct表示，以GAPDH为内参计算相对表达量。

1.3.4Western印迹检测Arnt2、Npas4蛋白表达情况 RIPA缓冲液提取白细胞中蛋白并测定浓度，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭2 h，室温下分别滴加鼠抗人Arnt2单抗隆抗体(1∶1 000)、兔抗人Npas4单抗隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜；次日滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下避光孵育2 h，曝光、显影后用Image J分析条带灰度值，以GAPDH为内参计算相对表达量。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组事件相关电位P300潜伏期及波幅 与对照组相比，入院1 w内和2 w后的脑卒中后抑郁组、原发性抑郁组、脑卒中组患者P300潜伏期显著延长，P300波幅显著降低(P<0.05)；与原发抑郁组和脑卒中组相比，脑卒中后抑郁组P300潜伏期显著延长，P300波幅显著降低(P<0.05)；入院2 w后脑卒中后抑郁组、原发性抑郁组、脑卒中组较入院1 w内 P300潜伏期显著缩短，P300波幅显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

2.2各组外周血Arnt2、Npas4 mRNA表达情况 脑卒中后抑郁组和原发性抑郁组Arnt2 mRNA相对表达量明显高于脑卒中组和对照组，Npas4 mRNA相对表达量明显低于脑卒中组和对照组(均P<0.05)；脑卒中后抑郁组Arnt2 mRNA和Npas4 mRNA相对表达量与原发性抑郁组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

表1 各组入院1 w内和2 w后 P300潜伏期、波幅比较

与对照组相比：1)P<0.05；与原发抑郁组相比：2)P<0.05；与脑卒中组相比：3)P<0.05；与入院1 w内比较：4)P<0.05

图1 各组事件相关电位P300波形

组别nArnt2 mRNANpas4 mRNA脑卒中后抑郁组471.85±0.151)2)0.87±0.111)2)原发性抑郁组521.41±0.241)2)0.82±0.231)2)脑卒中组451.03±0.321.31±0.44对照组290.86±0.101.24±0.47

与脑卒中组相比：1)P<0.05；与对照组相比：2)P<0.05

图2 各组Arnt2、Npas4 mRNA扩增电泳图

2.3各组外周血Arnt2、Npas4 蛋白表达情况 脑卒中后抑郁组和原发性抑郁组Arnt2 蛋白相对表达量分别为(5.91±1.13)、(5.57±0.96)，明显高于脑卒中组和对照组(3.26±1.38)、(2.91±1.05)；Npas4 蛋白相对表达量分别为(2.51±0.84)、(2.40±0.93)，明显低于脑卒中组和对照组(7.16±1.18)、(7.86±1.29)，差异均有统计学意义(均P<0.05)；脑卒中后抑郁组Arnt2和Npas4蛋白表达与原发性抑郁组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见图3。

图3 各组外周血Arnt2、Npas4 蛋白电泳条带

3 讨 论

老年人群中抑郁症患病率高达10%～20%〔4〕，目前认为老年抑郁症的发生多由应激事件或年龄相关大脑退行性病变诱发，导致长期下丘脑-肾上腺-皮质醇功能失调，皮质醇分泌量增加，长期作用于海马中相应受体引发海马萎缩和功能丧失〔5〕。脑细胞属于不可再生的永久性细胞，脑卒中可造成大脑神经细胞损伤，易出现抑郁及认知功能障碍，其不但增加了家庭和社会负担，还提升了患者死亡率〔6〕。事件相关电位中P300受外界物理因素影响程度较小，能够较为客观地反映受试者记忆、感知等大脑高级功能情况，因此本研究观察患者P300波幅和潜伏期的变化〔7〕。研究结果提示脑卒中后抑郁和脑卒中后均会出现认知功能障碍，且脑卒中后抑郁患者认知功能损伤更为严重；脑卒中后抑郁患者与原发抑郁者相比，不仅存在精神运动障碍，还会减慢大脑对外界信息的处理速度，脑卒中对大脑组织的损伤也会加重认知功能伤害。

Arnt2属于碱性螺旋转录因子超家族，在细胞周期、分化、应激反应相关调控基因表达网络中起重要调控作用〔8〕。Npas4与Arnt2属于相同家族，在大脑发育、突触生成和维护等方面发挥重要作用，是大脑重塑的关键因子〔9〕。动物实验显示，孤氧并行为限制的小鼠海马体积较正常同龄小鼠降低7.2%，并伴有神经受损，其中海马中的Npas4表达明显下调，Arnt2表达明显上调〔10〕，提示Npas4表达下调和Arnt2下调可能应激诱导海马功能损伤。相关研究显示，Arnt和Npas家族成员广泛分布于人淋巴组织中，故本次研究通过外周血分离白细胞，检测其中Arnt2 和Npas4 mRNA和蛋白表达水平〔11〕。本研究结果说明Arnt2高表达和Npas4低表达可诱导海马神经功能受损，使患者出现情绪失调，引发认知障碍。