克拉维酸钾配伍阿莫西林治疗对老年肺结核外周血自然杀伤细胞表面受体及肺组织中B、T淋巴细胞衰减子表达的影响

侯志强 齐亚萌

(天津医科大学第二医院，天津 300211)

老年肺结核病情不明显，检查结果容易受多种因素干扰，给病情的诊断和治疗带来了很大困难〔1〕。肺结核发病机制是由免疫功能损伤引起的〔2〕，老年患者的免疫功能减退也是老年人群易感的重要原因，若不能及时治疗，病情迅速发展，则难以逆转。自然杀伤(NK)细胞是构成细胞免疫的重要部分，NK细胞的活化受抑制受体(NKG2A)和活化受体(NKG2D)的作用，两者的表达平衡才能使得NK细胞发挥正常的作用〔3〕。研究表明B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)在肺结核免疫调节中发挥重要作用〔4〕。克拉维酸钾和阿莫西林是临床上新兴的治疗肺结核的有效药物，本研究探讨克拉维酸钾配伍阿莫西林治疗老年肺结核对患者NK细胞表面受体NKG2A和NKG2D及BLTA表达的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2014年1月至2015年1月在天津医科大学第二医院收治的老年肺结核患者120 例，所有患者符合中华医学会结核病学会制定的《肺结核诊断及治疗指南》中的诊断标准〔5〕，纳入标准：①痰检结果显示抗酸杆菌涂片为阳性〔6，7〕，或痰菌阴性，经培养显示痰标本中有结核分支杆菌；②经胸部X线等影像学检查确诊为肺结核，有渗出性胸腔积液，或活动性肺结核；③患者存在咯血、咳痰、盗汗、发热、胸闷气短等症状。排除标准：①严重心血管疾病；②肝肾功能异常；③肺尘埃沉着病、糖尿病等慢性病者；④有精神病史者。将所有患者随机分为研究组及对照组，各60 例，研究组男37例，女23例，年龄60～82〔平均(68.5±3.7)〕岁，肺结核病史0～30〔平均(15.8±2.3)〕年，合并肺外结核32例(其中单侧胸腔积液15例，双侧胸腔积液11例，双肺弥漫间质病变4例，亚急性血播型2例)。对照组男35例，女25例，年龄60～80〔平均(69.4±3.1)〕岁，肺结核病史0～29〔平均(15.1±2.6)〕年，合并肺外结核34例(其中单侧胸腔积液16例，双侧胸腔积液10例，双肺弥漫间质病变5例，亚急性血播型3例)。两组性别、年龄、病程等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究所有内容经医院伦理委员会批准，所有患者及家属知情且签署知情同意书。治疗6个月后研究组患者有2人失访，对照组患者有1人失访，2人退出研究。

1.2方法 对照组采用左氧氟沙星治疗，0.2 g/次， 3次/d，并在此基础上加用力克肺疾(Dipasic，D，重庆华邦制药股份有限公司，生产批号20030903)0.2～0.3 g/次，3次/d，利福喷丁(上海信宜万象药业股份有限公司，生产批号：55131101)0.45 g/次，2次/w，盐酸乙胺丁醇(杭州民生药业集团有限公司，生产批号：010863)0.75 g/次，顿服。研究组在对照组基础上加用阿莫西林克拉维酸钾分散片(4∶1)(浙江亚太药业股份有限公司，生产批号：6121118)进行治疗，2片/次，3次/d。

1.3疗效评价 X线检查评价肺部病灶吸收情况：显效：病灶全部吸收或吸收1/2以上；有效：病灶出现明显吸收，但吸收在1/2及以下；无效：病灶无吸收，或进一步恶化〔8〕。显效率=显效/患者总数×100%，有效率=(显效+有效)/患者总数×100%。

1.4观察指标和检测方法 分别于治疗前、治疗后3、6个月观察痰菌阴转率、肺部病灶吸收、空洞闭合率情况、NK细胞表面受体表达率、肺组织中BTLA表达情况及不良反应发生率。

1.4.1NKG2A和NKG2D检测 NKG2A检测：所有患者于治疗前、治疗后3、6个月空腹状态下抽取2 ml上肢静脉血，加入EDTA抗凝，将其与等量的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，并注入淋巴细胞分离液表面，将核细胞分离并用PBS缓冲液冲洗得细胞悬液，于1 200 r/min离心5 min，留沉淀并用100 μl PBS缓冲液重悬。向管内各加入10 μl的NKG2A-PE、CD56-FITC及CD3-PE-Cy5(购自R&D System公司)。NKG2D检测：向管内加入NKG2D-PE、CD56-FITC及CD3-PE-Cy5(购自R&D System公司)，其余步骤相同，于4℃下放置30 min。同时设定阴性对照。于1 000 r/min离心10 min，弃去上清，PBS缓冲液冲洗两次，移入流式管中待测。NKG2A和NKG2D检测采用流式细胞仪进行。分析结果，统计阳性细胞百分比。

1.4.2BTLA表达测定 采用PV二步法进行免疫组织化学染色进行检测，试剂盒均购自R&D System公司，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。取5 μm的组织切片，常规脱蜡，用1%的过氧化氢(H2O2)处理，然后高压修复2 min，采用鼠抗人BTLA单克隆一抗(1∶150浓度)于4℃下放置过夜，然后用PBS缓冲液冲洗干净，滴加二抗，37℃孵育，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色及苏木精染色。图像分析采用IPWin32采集系统进行，行组织化学染色BTLA免疫组织化学(IHC)评分，并半定量分析BTLA的表达水平。

1.5统计学处理 采用SPSS18.0软件行χ2及t检验。

2 结 果

2.1两组痰菌转阴率比较 治疗3个月，研究组痰菌转移率显著高于对照组(P<0.05)；治疗6个月，两组痰菌转阴率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2两组肺部病灶吸收情况比较 治疗3个月，研究组病灶吸收显效率和有效率显著高于对照组(P<0.05)；治疗6个月，研究组显效率显著高于对照组(P<0.05)，两组有效率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3两组空洞闭合率比较 治疗3个月和治疗6个月时，研究组空洞闭合率均显著高于对照组(P<0.05)。见表3。

表1 两组痰菌转阴率比较〔n(%)〕

表2 两组肺部病灶吸收情况比较〔n(%)〕

表3 两组空洞闭合率比较〔n(%)〕

2.4两组NKG2A和NKG2D表达水平比较 治疗前，两组NKG2A和NKG2D阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3个月和6个月时，两组NKG2A阳性率显著降低，NKG2D阳性率显著升高，与治疗前比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，研究组NKG2A阳性率显著降低NKG2D阳性率显著增高(P<0.05)。见表4。

2.5两组BTLA水平比较 治疗前两组BTLA IHC评分比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3个月与6个月时，两组BTLA IHC评分均显著降低(P<0.06)，且研究组与对照组比较评分显著降低(P<0.05)。见表5。

2.6两组不良反应比较 两组恶心、肝功能损伤、食欲不佳等不良反应发生情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，均经治疗得到恢复，且对其正常治疗无影响。见表6。

表4 两组NKG2A和NKG2D阳性率比较

与对照组比较：1)P<0.05，与本组治疗前比较：2)P<0.05，下表同

表5 两组BTLA IHC评分比较分)

表6 两组不良反应发生情况比较〔n(%)〕

3 讨 论

老年人群具有生理、心理等的相对脆弱性，相比于年轻人群对肺结核的抵抗能力差，身体各器官功能及众多并发症导致药物治疗效果降低、不良反应发生骤增，且患者的治疗连续性、依从性差。本研究显示克拉维酸钾配伍阿莫西林治疗痰菌转阴率高，疗效确切。目前，临床上应用克拉维酸钾配伍阿莫西林治疗肺结核耐药菌株少，利于小剂量就可以发挥治疗效果。随着肺结核疾病进展，病灶部位会出现慢性纤维空洞、病灶渗出液、胸膜粘连等，进而导致病情转移造成难以回逆的器官损害，患者也会出现咯血、咳脓痰、咳嗽等情况〔9〕，此时必须联合一定量的抗生素进行治疗。阿莫西林克拉维酸钾分散片是羟氨苄青霉素和克拉维酸(β-内酰胺酶抑制剂)的复合药物，其中的克拉维酸能够增强阿莫西林的抗菌活性，拓宽抗菌种类，有利于减少耐药菌的产生〔10，11〕。

NK细胞是体内多种免疫细胞的调节细胞，肺结核能够导致机体内NK细胞数量下降和活性显著降低。NK细胞的活性受其表面受体NKG2A和NKG2D的影响，NKG2A和NKG2D通过传递抑制和活化信号，调节NK细胞的活性，同时NK细胞进过达CD56〔12〕。本研究表明克拉维酸钾配伍阿莫西林能够提升NK活性。当结核菌入侵到机体内后，若机体的抵抗作用较强，结核菌会转为隐性感染，而当机体免疫力下降时，结核菌会转为显性感染，并开始向其他部位扩散。研究表明，正常人群的外周血NK细胞活性显著高于肺结核人群，NKG2A表达增加，这与本研究的结果相似。肺组织BTLA是一类免疫球蛋白的相关性蛋白，BTLA能够与疱疹病毒侵入介质(HVEM)结合，活化相应抑制性信号通路。BTLA在T淋巴细胞、B淋巴细胞等多种免疫细胞中均有表达〔13〕。在肺结核发病中，BLTA参与了病原菌对肺组织的免疫损伤过程。面对老年肺结核人群，需要更加合理的方案，做到治疗期间安全有效、副作用少、能明显改善患者症状，提升患者生存质量，并在长期上降低其复发率。克拉维酸钾配伍阿莫西林是近期新兴的治疗肺结核的药物，临床上具有利于痰菌转阴、低毒性、安全性高等优点，联合乙胺丁醇使用更具有良好的杀菌效果。本研究显示，对老年肺结核患者采用含阿莫西林克拉维酸钾分散片的联合治疗方案,近期疗效确切,药物不良反应少,能够显著改善患者的免疫功能状态，调节NKG2A、NKG2D及BTLA的表达。