一例黄羽肉鸡感染QX型IBV的实验室诊断

杨瑞 ，陈良健 ，刘裕玲 ，张建军 ，颜彩霞 ，李旭进 ，罗宇山 ，陈伟

（1.国药集团扬州威克生物工程有限公司，江苏 扬州 225127；2.广东省台山市动物疫病预防控制中心，广东 台山 529200；3.广东省云浮市新兴县簕竹镇畜牧兽医水产站，广东 云浮 527400）

禽传染性支气管炎 （avian infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV）引起的鸡的一种急性、传播迅速的病毒性疾病。IBV可导致肉鸡的增重和饲料报酬降低；肉鸡呼吸道损伤后，还会引起继发性的细菌感染，导致高达30%以上的死亡率；有些毒株可以引起严重的肾病病变[1，2，3]。也有研究报道，某些IBV毒株可引起输卵管病变，导致产蛋率下降，畸形蛋数量增多，蛋壳颜色发生改变等；而雏鸡感染IBV后还会导致输卵管不能正常发育造成“假母鸡”。S1蛋白与IBV感染性、致病性密切相关，含有与病毒中和、细胞吸附、组织嗜性、血清型有关的抗原位点，也是最容易发生遗传变异的结构蛋白；因此S1基因序列被常用于IBV的 基因分 型[2，3，4]。

2017年12月份，广东省台山市某养殖场所饲养的黄羽肉鸡发生了一种以呼吸困难、潜伏期短、发病速度快为主要特征的疫病；以支气管有粘液或干酪样物为主要剖检病变。通过实验室诊断技术结合临床症状和流行病学等进行综合分析，将此次疫病确诊为QX型IBV感染所致；现将其进行阐述以期广大养殖企业加强该病的诊断和防治。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基和普通琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；RNA提取试剂盒及反转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 样品采集 对患病鸡进行剖检，观察病变状况；无菌采集病变较明显的气管、肺脏、肾脏等组织。

1.3 细菌分离 无菌采集肝脏，接种麦康凯琼脂平板和血平板进行细菌分离，37℃培养24h左右，观察结果。

1.4 病毒分离 将采集的脏器组织用灭菌PBS（pH7.2）按1:5进行充分研磨，反复冻融三次后，接种10日龄SPF鸡胚，37℃恒温培养5d，收获尿囊液并观察鸡胚胚体病变。

1.5 PCR检测 将收获的尿囊液，按照试剂盒说明书提取总RNA，通过RT-PCR方法检测IBV。参考文章[5]中发表的S1序列设计1对引物：

上游引物序列为：

5'-TTGAAAACTGAACAAAAGACCG-3'，

下游引物序列为：

5'-TACAAAACCTGCCATAACTAACAT-3'。

预计扩增片段约为1600bp。

1.6 S1基因序列的序列测定及分析 将扩增的目的片段，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。利用MEGA4.1软件对所测S1基因序列进行分析，并与世界各地已报道的部分分离毒株进行序列比对及遗传进化分析。

2 结果

2.1 剖检病变 对送检病鸡进行剖检发现，肾脏肿大，支气管内有栓塞，其它脏器眼观无异常，肾脏、支气管的病理变化见图1、图2。

图1 肾脏肿大

图2 支气管栓塞

2.2 细菌分离 置于37℃恒温培养24h后，麦康凯琼脂平板和血平板培养基上均未观察到任何细菌生长，故可以排除细菌感染。

2.3 病毒分离 将采集的气管、肺脏、脾脏等组织充分研磨后接种10日龄SPF鸡胚，连续培养5d后，鸡胚胚体呈侏儒状，呈IBV感染典型病变，如图3所示。

图3 鸡胚病变

2.4 PCR检测及序列分析 电泳结果显示，以收获鸡胚尿囊液所提取的RNA为模板，通过RTPCR可扩增出与目的片段大小相符的特异性条带，如图4所示。

图4 S1基因PCR产物电泳结果

利用生物信息学软件MEGA 4.1分析所测S1基因序列，并与世界各地已报道的部分分离毒株进行序列比对及遗传进化分析，发现该分离株与QX型IBV的同源性高达96%以上，可以确定引起此次疫病的病原为QX型IBV。S1基因序列的系统进化树见图5。

图4 S1基因序列的系统进化树

3 讨论

IBV最早在1930年于美国的北达科他州被发现；邝荣禄于1972年在我国广东省首次出报道；目前，已然成为危害家禽养殖的重要疫病之一。IBV可在哈德氏腺、呼吸道、肠道、肾脏、输卵管以及公鸡的睾丸等多种组织器官中复制。一般来说不论IBV分离株来自何种组织，它们都易感染鸡的呼吸道并在气管产生特征性病变，一些野毒株还会引起严重的呼吸道症状。根据临床调查发现，大多数毒株既能引起呼吸道症状也能引起肾脏的病变，而且随着外界环境条件、感染年龄等差异表现出的致病特点也存在差异[2，5]。

由于RNA病毒的复制过程中缺乏错误修复机制，因此对于IBV而言，遗传变异是一个非常普遍的现象，基因组的点突变、碱基插入或缺失以及不同毒株间的基因重组均可造成的变异。据报道，在我国当前流行的毒株基因型数量超过10个，包括 QX 型、CK/CH/LSC/99I型、LDT3/03 型、793/B型和 TW-I型、TW-II型、HN03 型、CH III型、CH VI型等；其中QX型己经成为当前在我国流行的最主要的优势基因型，毒株数量己经占到分离总数的 50%以上，且还在呈现逐年增长的趋势[2，3，4]。我国目前所使用的疫苗主要是LDT3型和以H120、H52、W93、28/86、Ma5 等为代表的 Mass 型疫苗；大量的研究结果表明，现有疫苗已经不能对当前流行的部分基因型毒株产生良好的免疫保护，防控形势异常严峻。据了解，扬州大学吴艳涛教授团队通过大量的流行病学分析及疫苗株筛选等工作，研发了与当前IBV流行趋势相匹配的疫苗，目前已经进入新兽药申请阶段，此疫苗的推出可能对当前主要流行的QX型IBV防控发挥重要作用。

针对IBV的防控，建议做好以下几点：①制订严格的生物安全措施并认真执行。养殖小区实行全进全出制、严格检疫、隔离、消毒等措施，防止IBV的侵入及扩散；②制订科学合理的免疫程序。目前，在与流行的优势基因型匹配的QX型疫苗尚无法获得的情况下，可通过将现有疫苗组合进行联合免疫从而增加广谱的交叉免疫保护效果。对于生长期较长的黄羽肉鸡，一般需要进行3次左右的活疫苗免疫；20日龄左右增加一次灭活疫苗；③加强饲养管理。定期对所饲养的鸡群进行免疫检测，及时了解鸡群的健康状况，尽量避免发生混合感染或继发感染。大量的临床数据表明，当鸡群发生混合感染或继发感染时发病率和死亡率均有大幅的增加；目前己经发现IBV与大肠杆菌、支原体和H9亚型低致病性禽流感病毒之间存在明显 的 协同 致 病作 用[4，5，7]。