酶联免疫吸附试验简析

刘红祥，孔宪好，钟声

(青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266000)

近年来，畜牧业在国家调控政策及市场需求影响下得到快速发展，但随着世界范围内养殖业规模的不断扩大，疾病对养殖危害也随之加剧，某些常规检测技术已经不能适应行业快速发展需求，伴随着检测技术的进步，ELISA技术以其灵敏度高、特异性强、操作步骤简单快捷、安全性高、污染少等优点越来越应用广泛，在疾病诊断、免疫效果评价方面具有实际指导意义。

1 ELISA原理

1.1 使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。

1.2 使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。

1.3 酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，颜色的深浅与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或半定量分析。

2 ELISA方法

2.1 方法一：双抗体夹心法 其步骤见图1。

图1 双抗体夹心法

2.1.1 固相载体包被的是特异性抗体或抗原，多数检测的是抗原为主，大分子抗原应用较多,如家禽的P27抗原检测（IDEXX)。

2.1.2 颜色反应为有明显颜色为阳性。

2.2 方法二：间接法 其步骤见图2。

图2 间接法

2.2.1 固相载体包被的是特异性的抗原，检测的是抗体，如目前家禽传染性支气管炎（IB）、呼肠孤（REO）、传染性法氏囊（IBD）、鸡毒支原体（MG）、滑液囊支原体（MS）、禽肺病毒感染（APV）、禽脑脊髓炎（AE）的 ELISA 抗体；家畜蓝耳病（PRRSV）、猪圆环病毒病PCV2、口蹄疫（FMD）的ELISA抗体等。

2.2.2 颜色反应为有明显颜色为阳性，且颜色的深浅可以反应抗体的高低。

2.3 方法三：竞争法 其步骤见图3。

图3 竟争法

2.3.1 固相载体包被的是特异性的抗体或抗原，可以检测抗体也可以检测抗原。如家畜中猪瘟抗体，伪狂犬GB/GI抗体等。

2.3.2 颜色反应为有明显颜色为阴性，反之为阳性。

3 ELISA操作注意事项

3.1 实验前注意要点

3.1.1 移液器、滴头 移液器定期及时校正，保证微量加样的准确性；滴头一次性使用。

3.1.2 试剂盒的预温 实验室温度控制在20～25℃的前提下，提前2h预温，保证试剂盒中的各组分温度均一。

3.1.3 洗液的配制 根据试剂盒的要求提前进行稀释且使用时恢复至室温，如IDEXX 10*。

3.1.4 血清样品的预处理 血清保证新鲜，2～8℃保存不超过7d；长期保存需冷冻，避免反复冻融以免影响效价；血样溶血勿用，红细胞释放的具有过氧化物酶活性的物质可造成非特异性的显色反应；血样尽量无菌以免产生假阳性；解冻后血清要轻柔颠倒混匀，避免强烈震荡，如浑浊要离心取上清使用。

3.1.5 血清样品稀释 根据试剂盒的要求对血样进行相应的稀释（如：禽 500倍，猪2倍、5倍、40倍、100 倍）。

特别注意取样时要准确且滴头外壁的残留血清要剔除，加样后要切记混匀。

500倍稀释方法见以下三步：

第一步：10μl血清加入到 90μl的稀释液（10倍）；第二步：取10倍稀释的样品加入到 90μl的稀释液（100倍）；第三步：取 100倍稀释的 20μl的样品加入到80μl的稀释液中（500倍）。

3.2 实验中注意的要点

3.2.1 加样 稀释好的样品加入时悬空或不贴底壁，加样在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁的上部，加入过程中不可产生气泡，保证每孔中液体相同。

3.2.2 孵育 保证孵育温度的适宜，ELISA板不要直接在温度偏低的试验台面上孵育，还要加盖或封膜板。

3.2.3 洗涤 稀释好的洗液室温下洗板且不能溢出，每次洗板的过程中要垂直甩板，甩干净且在反应孔没有干的情况下加入下一步试剂，试验操作中避免手接触反应板底部，以免影响实验结果。

3.2.4 酶标抗体、底物、终止液 酶标抗体剩余不能倒回原瓶，底物应避光使用。

3.2.5 酶标仪读数 酶标仪提前15min开启，且加完终止液后15min内读数，正确使用相应波长滤光片且定期校正检查滤光片。