24个Y-STR基因座的法医学应用评估

李 敏 ，黄 磊 ，王新杰 ，陈玉玲 ，盛 翔 ，李亚男 ，包 云 ，姜 磊 ，朱如心 ，徐倩南 ，张家硕 ，李成涛 ，边英男

（1.温州医科大学基础医学院法医学系，浙江 温州 325235；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.山东省公安厅，山东 济南 250001；4.潍坊市公安局，山东 潍坊 261061；5.华东理工大学生物工程学院 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；6.苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；7.内蒙古医科大学法医学教研室，内蒙古 呼和浩特 010030）

Y-STR具有重要的法医学应用价值，被广泛用于男性家系排查和性犯罪男女混合成分检验等公安实战和父系血缘关系评价当中[1-5]。Y-STR在取得可喜成绩的同时也遇到了一些问题，由于Y-STR在不同种族中的遗传异质性和目前广泛使用的商品化试剂盒多以国外人群为主体参考样本而开发，开发过程中虽经过一定量中国人群验证，但是其中一些基因座在大规模应用中已经表现出了适应性不佳等问题[6-8]。部分试剂盒为提高单倍型识别能力特地加入了快速突变位点[9]，然而这又给家系排查带来了困扰。因此，本课题组在前期工作的基础上[10]，以山东人群为参考样本，甄选并建立了由24个Y-STR基因座（DYS426、DYS434、DYS531、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS391、DYS570、DYS635、DYS448、DYS593、DYS645、DYS393、DYS389 Ⅰ 、DYS390、DYS389 Ⅱ 、DYS596、DYS576、DYS458、DYS481、DYS385a/b、DYS443）构成的单倍型识别力较强、突变率适中、兼容性较好的YSTR复合扩增系统。本研究通过山东济南汉族男性无关个体样本对此扩增系统进行法医学应用评估，以期为探索适合我国人群的Y-STR标记系统提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究共收集并检验了139对父子的血痕样本，所有志愿者均来自山东济南汉族人群。样本采集均遵循知情同意原则。

1.2 试剂与仪器

DNA标准品9948及9947A（美国Promega公司）和Hi-DiTM甲酰胺（美国AB公司）。9700型PCR仪（美国AB公司）和3130xl型基因分析仪（美国AB公司）。

1.3 位点说明

本研究评估的24个Y-STR基因座为DYS426、DYS434、DYS531、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS391、DYS570、DYS635、DYS448、DYS593、DYS645、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS390、DYS389Ⅱ、DYS596、DYS576、DYS458、DYS481、DYS385a/b 和 DYS443。其中，DYS19、DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS439、DYS448、DYS458、DYS635共14个基因座源自于欧洲YHRD（http://www.yhrd.org）推荐的 17 个基因座（除 DYS437、DYS438、DYS456、Y-GATA-H4 外）。根据本课题组前期研究[6]和文献[7]报道，此14个基因座在山东人群中多态性良好、突变率适中，并且对单倍型识别能力贡献较大，因此予以保留在系统。此外，考虑到本系统与其他商品化试剂盒的兼容性，我们保留了最小单体型（minimal haplotype，MHT）全部 9 个核心基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392和DYS393）。在此基础上，根据我国山东人群[10-11]特点，按照突变率尽可能低和单倍型区分能力尽可能强的原则，筛选并添加了DYS443等11个基因座组成了24个Y-STR的复合扩增体系。其中，DYS426、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645均为前期研究[7]中突变率较低的位点，以便于利用Y-STR进行家系排查。

1.4 PCR扩增和分型

本研究采用课题组自行构建的五色荧光检测体系对24个Y-STR基因座进行复合扩增。扩增采用10μL 体系，其中包括 6.0μL 去离子水、2.0μL 5×PCR反应预混液Ⅳ、2.0 μL 5×24Y引物混合物和直径1.2mm的血痕样本（FTA卡）。扩增条件：95℃ 2min；94℃ 5 s，60℃ 1 min，（30±1）个循环；60 ℃ 10 min；15℃低温保存。扩增反应同时设置阳性和阴性对照分别为DNA标准品9948和9947A。扩增反应于9700型PCR仪在MAX模式下完成后，立即对扩增产物进行毛细管电泳检测，具体过程：取1μL扩增产物加于9μL上样液（Hi-DiTM甲酰胺与内标ORG-500的17∶1混合液）中，经95℃ 3min后冰浴3min，短暂离心后在3130xl型基因分析仪上进行毛细管电泳检测，进样时间为5s，电压为3kV。电泳结果通过GeneMapper®ID v3.2.1软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行STR基因座分型，并根据国际法医遗传协会（the International Society for Forensic Genetics，ISFG） 最新推荐标准[12]进行各Y-STR等位基因的命名。

为了保证试剂盒的分型效果和准确性，选取9948、007、2800M标准品和从139对父子对中随机抽取的3例样本与AmpFℓSTRTMYfilerTM直扩试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行平行检测。

1.5 统计学处理

单倍型和等位基因频率由直接计数法分析获得，并计算每个基因座的突变率及其95%置信区间（http://statpages.org/confint.html）[13]。 基因多样性（gene diversity，GD）和单倍型多样性（haplotype diversity，HD）根据Nei的公式[14]计算获得，即

式中，Pi为第i个等位基因（或单倍型）的频率，n为检测样本总量。单倍型识别率（discriminative capacity，DC）的计算公式为

式中，Ndiff为单倍型种类数目，N为样本总量。

2 结 果

2.1 分型结果

实验结果显示，各样本在24个Y-STR基因座均得到有效扩增，各个基因座扩增产物峰高均衡性较好。使用AmpFℓSTRTMYfilerTM直扩试剂盒平行验证的结果显示，标准品及随机抽取的3例样本在共有基因座的分型结果均完全一致，其中标准品9948的分型结果如图1所示。

图1 标准品9948分型结果

2.2 等位基因频率和基因多样性

24个Y-STR基因座在139名标记为“父”的山东济南汉族无关男性个体中的等位基因频率如表1所示。24个Y-STR基因座在139名山东济南汉族无关男性个体中共观察到176个等位基因。单拷贝STR基因座的等位基因频率范围为0.007 2～0.956 8，多拷贝STR基因座DYS385a/b的基因型频率范围为0.0072～0.1007。

24个Y-STR基因座的GD值见表2。24个Y-STR基因座的GD值为0.0837～0.9669，其中21个基因座的GD值均大于0.5，比例高达87.5%，在山东汉族人群中展现出较高多态性。多拷贝基因座DYS385a/b拥有最高的GD值（0.9669），紧随其后的是基因座DYS570（0.8247）。 基因座 DYS645的 GD 值最低（0.0837）。

表1 山东济南地区汉族无关个体24个Y-STR基因座的等位基因分布频率 （n=139）

表1（续）

表2 山东济南地区汉族无关个体24个Y-STR基因座GD值、标准品DNA 9948分型、等位基因范围（n=139）

2.3 单倍型多样性

研究结果显示，24个Y-STR检查系统在139名山东汉族男性无关个体中共检测出139种单倍型，无共享单倍型现象出现。系统的HD、DC值均为1。

2.4 突变率评估

如表3所示，24个Y-STR基因座在139对父子间的3336次减数分裂中共观察到5次一步突变，分别为 DYS390基因座 1次、DYS458基因座 1次、DYS385a/b基因座2次和DYS443基因座1次。24个Y-STR基因座的平均突变率为0.001 5，95%置信区间为（0.0005，0.0035）。本研究在YHRD推荐基因座以外新增的 11 个基因座中（DYS426、DYS481、DYS570、DYS576、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645）的平均突变率为0.000 7，95%置信区间为（0.000 0，0.003 6），其中在现有商品化试剂盒中鲜有出现的 DYS426、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645的平均突变率为0.0010，95%置信区间为（0.0000，0.0057）。

表3 山东济南地区汉族139个父子对在24个Y-STR基因座的突变情况

3 讨 论

本研究的24个Y-STR基因座中有21个基因座的GD值均大于0.5，比例高达87.5%。根据文献[15-16]报道，以目前广泛使用的AmpFℓSTRTMYfilerTMPCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）为例，其GD值均大于0.5的基因座比例在82.4%～88.2%，因此本研究的24个Y-STR基因座具有较高的多态性。本研究在YHRD推荐基因座以外新增的11个基因座中有9个GD值大于0.5，其中 DYS434、DYS443、DYS531、DYS593和DYS596在现有商品化试剂盒中鲜有出现。因此，本研究的24个Y-STR系统不但可以独立应用，而且可以为商品化试剂盒提供补充。

由于Y-STR的连锁遗传，虽然考察各基因座GD值对于基因座的筛选具有一定意义，但简单将GD值最高的基因座组合得到的位点系统并不必然具有最高的HD和DC，即未必有最好的个体识别能力。因此，评估Y-STR系统法医学应用前景的决定性指标是HD和DC。本研究的24个Y-STR检查系统，在139名山东汉族男性无关个体中未观察到共享单倍型现象，其HD值和DC值均为1。目前广泛使用的AmpFℓSTRTMYfilerTMPCR扩增试剂盒 HD值和DC值分别在 99.97%[17]～99.99%[18]和 76.14%[17]～98.66%[18]，表明该系统具有较高的单倍型识别能力和良好的法医学应用前景。

本研究的24个Y-STR基因座在139对父子间的3 336次减数分裂中共观察到5次突变，平均突变率为 0.0015，95%置信区间为（0.0005，0.0035）。 其中在24个基因座中YHRD推荐基因座以外新增的11个基 因 座 （DYS426、DYS481、DYS570、DYS576、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596 和DYS645）的平均突变率为0.000 7，95%置信区间为（0.0000，0.0036），而在现有商品化试剂盒中鲜有出现的 DYS426、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645基因座的平均突变率为0.0010，95%置信区间为（0.0000，0.0057）。 目前广泛使用的 AmpFℓSTRTMYfilerTMPCR 扩增试剂盒、AmpFℓSTRTMYfilerTMPlus PCR扩增试剂盒和PowerPlex®Y23 System试剂盒（美国 Promega 公司）突变率分别为 0.21%[19]～0.27%[20]、0.44[21]～0.46%[22]和 0.37%[23]～0.38%[24]。因此，本研究评价的系统可以在一定程度上降低因突变带来的困扰，特别是在作为其他试剂盒补充使用时，可以提供相当数量的低突变位点。

本研究在YHRD推荐基因座以外新增的DYS426和DYS645多态性较低，考虑到其突变率较低的特点，将其保留在本系统中，我们将在以后更大样本的研究中对其进行考察。Y-STR系统的应用效果会受到被检人群的影响。因此，本研究针对我国人群，以山东男性人群为参考样本，对前期甄选的24个Y-STR基因座进行了法医学评价，结果显示，该系统不但具有较强的单倍型识别力而且突变率适中，并且在与其他试剂盒具有一定兼容性的同时还可以作为目前广泛使用的商品化试剂盒的补充。结合王新杰等[4]的研究，本研究评价的系统在其他汉族人群中具有良好应用前景的可能性较高，但是最终效果仍须通过实际样本验证评估。希望通过对该系统的法医学评价，为探索适合本地区和我国人群的Y-STR标记系统提供参考数据。