药物辅助性犯罪案件中新型苯二氮幕卓类策划药2-氯地西泮的鉴定

（司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

药物辅助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）是指在中枢神经抑制剂、兴奋剂和致幻剂等精神活性物质影响下，实施的麻醉抢劫、性犯罪等不法行为[1]。其中药物辅助性犯罪（drug-facilitated sexual assault，DFSA）[2-3]案件，俗称迷奸案，是法医毒物鉴定中的一个特定案件类型[4]。典型的场景如酒吧中趁女孩不注意，将精神活性物质投入饮料中，利用其致人快速昏睡、幻觉、短暂记忆丧失等作用实施性犯罪。我国的药物辅助犯罪案件中，20世纪主要以麻醉抢劫为主[5]，进入21世纪，随着网络信息传播、网购易获得性的泛滥，DFSA案件急剧增长。

新型苯二氮菒卓类化合物是近两年猛增、在全球范围内泛滥的策划药[6-7]，是在常见临床药物地西泮、三唑仑等原有化学结构上进行修饰、引入基团而设计、制造。这些新型苯二氮菒卓类化合物并非临床使用，但被不法分子在网上公开贩卖，标以“弥漫之夜”“夜恋”“第四态未知元素”等名称，甚至还公然标注“无法检测、放心使用”，给社会安全、稳定带来极大的隐患。这些新型策划药进行实验室检测时缺少对照品和有效的检验确认方法，并且药代动力学与药理学研究和数据缺乏，给法医毒物鉴定带来极大挑战。

本研究从标有“弥漫之夜”的乳白色液体中确认新型苯二氮菒卓类策划药2-氯地西泮［又名diclazepam，2-chlorodiazepam，Ro5-3448；化学名 7-氯-5-（2-氯苯基）-1-甲基-1，3-二氢-2H-1，4-苯并二氮 杂 菒卓 -2- 酮 ，7-chloro-5-（2-chlorophenyl） -1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one；CAS号2894-68-0；化学结构见图1A］。由于2-氯地西泮存在同分异构体4-氯地西泮［又名4-chlorodiazepam，Ro5-4864；化学名 7-氯-5-（4-氯苯基）-1-甲基-1，3-二氢-2H-1，4-苯并 二 氮 杂菒卓-2-酮 ，7-chloro-5-（4-chlorophenyl）-1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one；CAS 号 14439-61-3；化学结构见图1B］，因此本研究亦对其进行区别。本研究将对2-氯地西泮进行结构确认，并开展法医毒物学讨论，希望为国内同行针对此类案件的解决提供参考。

图1 2-氯地西泮（A）和4-氯地西泮（B）的化学结构

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

UltiMate 3000 UHPLC液相系统和Thermo ScientificTMQ ExactiveTM组合型四极杆Orbitrap质谱仪质谱（LC-QE）、XcaliburTM3.0 软件（美国 Thermo Fisher Scientific公司）。

7890A GC-5975C MSD气相色谱-质谱联用（GCMS）仪、MSD ChemStation 工作站（美国 Agilent公司）。

AV-500超导核磁共振仪（1H-NMR，美国Bruker公司）。

2-氯地西泮（1 mg/mL，甲醇）购自美国Cerilliant公司；4-氯地西泮购自江苏艾康生物医药研发有限公司；甲醇（HPLC级）购自美国Sigma-Aldrich公司；甲酸和乙酸胺（色谱纯）来源于瑞士Fluka公司；超纯水为实验室Milli-Q超纯水系统自制；其他化学试剂及药品均为分析纯。

1.2 仪器条件

1.2.1 液相高分辨质谱条件

色谱条件：液相柱为Restek Allure PFP丙基柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），前接 Phenomenex保护柱（12.5 mm×2.1 mm，5 μm）。 流动相为 V乙腈∶V缓冲液=70∶30，缓冲液为20 mmol/L乙酸胺-0.1%甲酸溶液。恒流 200μL/min。

质谱条件：电喷雾电离-正离子模式（ESI+）。离子源电压3.5kV。壳气、辅助加热气和碰撞气均使用高纯氮。辅助加热温度300℃，毛细管温度350℃。质谱检测使用全扫描-信号触发二级质谱（full MS-ddMS2）模式，母离子全扫描的分辨率设为35 000（半峰宽），子离子的扫描分辨率为17500。全扫描范围质荷比（m/z）为 60～800，碰撞能量为 60、70、80eV。 在每批次进样分析前，用美国Thermo Fisher Scientific公司提供的校正液对质谱的质量轴进行校正，以使质量数偏差小于 5×10-6。

1.2.2 气相色谱-质谱联用仪条件

色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；载气为氦气，流速 1 mL/min；初温 100℃保持1.5min，以25℃/min程序升温至280℃保持15min。

质谱条件：进样口温度为250℃，离子源温度230℃，采用全扫描模式，质量范围m/z 50～500。

1.2.3 超导核磁共振仪条件

以CDCl3为溶剂，探头温度300.0K，所有实验均采用标准脉冲序列。

1.3 样品收集

警方提供的标有“弥漫之夜”的塑料瓶，内有约4mL乳白色液体。乳白色液体经检测未发现常见的毒（药）物成分。

1.4 样品前处理

取乳白色液体0.1 mL，置于10 mL离心管中，加入乙酸乙酯2mL，涡旋混合1min，以离心半径12cm，3000r/min，离心3min，转移有机层。检材中再加1滴10%NaOH 溶液，使检材呈碱性（pH=11～12），加入乙酸乙酯2 mL，涡旋混合1 min，以离心半径12 cm，3 000 r/min，离心3 min，合并乙酸乙酯提取液，于约60℃水浴中空气流下吹干，残留物加50μL甲醇复溶，取1μL进GC-MS。残留物中再加入200μL甲醇稀释，取5μL进LC-QE。

取乳白色液体2 mL，置于10 mL离心管中，加入二氯甲烷3 mL，涡旋混合2 min，以离心半径12 cm，3 000 r/min，离心 3 min，转移有机层，于约 60℃水浴中氮气流下吹干，供1H-NMR分析。

2 结 果

乳白色液体提取后首先经LC-QE分析，在2.7min处出现明显色谱峰（图2），特征质谱离子m/z分别为319.0390、321.0359、323.0323，应为同位素离子峰簇，峰簇的离子丰度比约为9∶6∶1，推测含有两个氯原子。限定结构式含两个氯原子、质量误差＜5×10-6，以精确质量数进行Xcalibur检索，准分子离子峰元素组成可能为C14H11Cl2N5或C16H13Cl2N2O。

经1H-NMR 分析（图 3），可见 10 组峰：3.81，3.84（d，1 H）；4.89，4.92（d，1 H）；7.03，7.04（d，1 H）；7.50，7.51，7.52，7.53（dd，1H）；7.29，7.31（d，1H）；7.37～7.39（m，1 H）；7.40～7.42（m，1 H）；7.37～7.47（m，1 H）；7.43～7.47（m，1 H）；3.43（s，3 H）。 质子总个数为 12，排除C14H10Cl2N5，元素组成应为C16H12Cl2N2O，精确质量数为318.0321，平均相对分子量为319.185。

图2 可疑色谱峰的LC-QE质谱图

图3 检材的1H-NMR结果

采用GC-MS分析，在11.16min有一特征碎片离子 m/z为 318、290、283、255的色谱峰。经美国国家科学技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）库检索，匹配度最高的化合物为7-chloro-5-（4-chlorophenyl）-1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one（即 4-氯地西泮），但匹配度只有66%。此外，该化合物与地西泮具有相同的特征碎片离子m/z为283、255，而分子离子峰m/z为318与283的质量数相差35（一个氯原子），进一步说明可能为一个氯原子取代的地西泮。由此推断该可疑化合物为4-氯地西泮的同分异构体，仅是氯的取代位置不一样。

为确认其结构，采用GC-MS分析2-氯地西泮和4-氯地西泮对照品。两种化合物虽然有相同的碎片离子（图 4～5），但保留时间不同，分别为 11.16 和 11.92min。该案中可疑化合物与2-氯地西泮具有相同的特征碎片离子，两者的保留时间误差＜1%，并且其1H-NMR结果与文献[8]中2-氯地西泮相一致（表1）。因此，最终确认，该案乳白色液体中检出2-氯地西泮成分。

图4 2-氯地西泮的GC-MS质谱图

图5 4-氯地西泮的GC-MS质谱图

表1 与文献[8]的1H-NMR结果比较

3 讨 论

2-氯地西泮目前尚不在GC-MS的NIST库中，如何分析、确认这些不包含在常规方法、标准谱库中的未知化合物是法医毒物化学的难点。高分辨质谱是未知化合物鉴定的首选[9]，具有高质量分辨率功能。本研究利用LC-QE，得到可疑化合物的精确分子量，再经同位素离子丰度比的解析，推测出元素组成。进一步经1H-NMR分析，基本锁定元素组成为C16H12Cl2N2O的目标物。如果能增加碳谱，则2-氯地西泮和4-氯地西泮结构区别更明确。但由于本研究购置标准对照品进行GC-MS和LC-QE分析，使两化合物通过色谱分离、区分、确认，因此不再进行碳谱分析。

2-氯地西泮和4-氯地西泮均属于新型苯二氮菒卓类化合物[10]。2013年，欧洲毒品和毒瘾监测中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction，EMCDDA）报道发现 2-氯地西泮，2016 年发现4-氯地西泮。2-氯地西泮最早合成于20世纪60年代，但未用于临床治疗，近些年出现在地下市场[8]。2-氯地西泮结构与地西泮相近，根据已有药理作用研究，与地西泮相比：2-氯地西泮对小鼠的肌肉松弛、镇静作用强1～2倍[8]；降低大鼠的运动活性和冲突活性的作用强4～8倍[11]；与γ-氨基丁酸A型受体结合的亲和力强30倍[12]。2-氯地西泮进入体内后主要为去甲基化、羟化代谢[8]，主要代谢物包括地洛西泮、氯甲西泮和劳拉西泮，均具有药理活性（图6）。2-氯地西泮的消除半衰期约42h，尿液中地洛西泮的检出时限约6 d，氯甲西泮和劳拉西泮的检出时限可分别达11d和19d[13-14]。4-氯地西泮虽然同为新型苯二氮菒卓类化合物，但与γ-氨基丁酸A型受体结合的亲和力弱，不同于常见苯二氮菒卓类化合物，其安眠镇静、抗焦虑等药理作用差，而是外周苯二氮菒卓受体的有效配位体，具有神经保护作用，目前被用于老年痴呆症等方面的治疗研究[15]。

图6 2-氯地西泮在体内的主要代谢途径

本研究针对DFSA案件中出现的完全未知化合物，采用LC-QE获得未知化合物的精确质量数，结合1H-NMR确定未知化合物的元素组成和分子结构式，通过GC-MS对特征碎片离子进行分析，最终将未知物结构确认为2-氯地西泮，为DFSA案件的侦查和定性提供直接证据。本项目研究者将在此研究基础上进一步扩大新型苯二氮菒卓类化合物筛选范围，不断积累阳性案例数据。