温度对死后大鼠肾组织FTIR光谱特征的影响

2018-07-23 03:35林汉成邓恺飞罗仪文孙其然张清华王振原孙俊红
法医学杂志 2018年3期
关键词:方根光谱误差

王 磊 ,王 琪 ,林汉成 ,黄 平 ,邓恺飞 ,罗仪文 ,孙其然 ,张清华 ,王振原 ,孙俊红 ,托 娅

(1.上海健康医学院基础医学院,上海 201318;2.山西医科大学法医学院,山西 太原 030001;3.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台,上海 200063;4.西安市公安局刑事侦查局技术处,陕西 西安 710038;5.西安交通大学医学部法医学院,陕西 西安 710061)

死亡时间(postmortem interval,PMI)推断一直是法医学研究的重点和难点[1-2]。近年来,傅里叶变换红外(Fourier transform infrared,FTIR)光谱技术在死亡时间推断研究中以其快速、准确和灵敏等特点展现出巨大的优势和潜力[3-4]。本课题组在前期研究中分析了常温(20℃)下死后大鼠肾组织FTIR光谱变化与死亡时间的关系[5],建立了死亡时间推断方法,但在鉴定实践中,死亡时间通常会受到温度、湿度、动物和人为破坏等多因素影响[6-7],使得应用FTIR光谱技术精确推断死亡时间面临挑战。

本研究结合FTIR光谱与数据挖掘技术,利用数据挖掘技术高准确率、高敏感性和高稳定性等优点[8-9],对不同温度下大鼠肾组织光谱数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘(partial least square,PLS)回归分析,并探讨温度对死亡时间推断PLS回归模型性能的影响,以优化死亡时间推断PLS回归模型性能,提高死亡时间推断准确性。

1 材料与方法

1.1 样本处理和取材

本研究所有动物实验经司法鉴定科学研究院科学与伦理委员会批准后进行。成年健康雄性大鼠30只,体质量240~280g(上海交通大学医学院提供),采用颈椎脱臼法处死后,将大鼠尸体分别置于4℃、20℃和30℃环境中,每个温度组10只。取大鼠肾皮质组织,大小约1 mm×1 mm×1 mm,其中4℃和20℃组大鼠分 别于 处死后 0、6、12、24、48、72、96、120、144 和168 h 取材,30℃组于处死后 0、6、12、24、36、48、60 和72h取材。每只大鼠肾组织样本重复收集,即每个时间点收集10个样本。检材经磷酸盐缓冲液洗涤后立即液氮冷冻。

1.2 数据采集

取液氮中保存组织置于衰减全反射(attenuated total reflectance,ATR)探头硒化锌晶体表面,下压ATR探头上的杠杆挤压大鼠肾组织,使之紧密贴附于晶体表面,用电吹风机(冷风)吹干组织。选用Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)采集光谱,扫描范围 4 000~900cm-1,分辨率4cm-1,每个样本重复扫描20次。

1.3 数据处理

所有光谱数据采用Unscrambler®X 10.4(挪威CAMO公司)和MATLAB®R2014a软件(美国Math Works公司)进行归一化和二阶导数预处理,然后利用Unscrambler®X 10.4软件对预处理后的光谱数据进行PCA。每个时间点随机选取8个样本的光谱数据建立校正集,其余2个样本的光谱数据建立预测集,采用留一法交叉验证建立死亡时间推断PLS回归模型。

PLS回归模型中决定系数(R2)、校正均方根误差(root mean square error of calibration,RMSEC)以及交叉验证均方根误差(root mean square error of cross validation,RMSECV)是校正模型的评估参数;预测均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)是模型外部验证参数,评估模型预测效果。

2 结 果

2.1 光谱预处理

在4 000~900 cm-1波数范围内测定大鼠肾组织FTIR图谱,其中1 800~900 cm-1为光谱信息指纹区,所以选取该段光谱进行研究[10]。所有光谱经预处理后均得到理想的FTIR光谱,图1为大鼠死后48h肾组织在不同温度下的平均光谱图(随机选取该时间点进行谱图展示)。

图1 大鼠死后48h不同温度下肾组织平均光谱图

2.2 光谱数据PCA结果

对4℃、20℃和30℃组中各死亡时间点光谱数据进行PCA,部分结果如图2所示。三个温度组中,死后 6 h(图 2A)、12 h(图 2B)和 24 h(图 2C)样本数据大致可以聚为两类,死后48h(图2D)和72h(图2E)样本数据则显著地聚为三类。在4℃和20℃组中,死后 96 h(图 2F)、120 h(图 2G)、144 h(图 2H)和 168 h(图2I)样本数据可清晰聚为两类。

由以上结果可知,三个温度下组织光谱差异在死后48h和72h较为明显。图3为大鼠死后48h和72 h光谱数据PCA主成分1的因子载荷图,可见主成分 1 的因子载荷于 1640cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1 404 cm-1等波数附近绝对值较高,反映了这些波数附近的因子(变量)对数据PCA样本聚类趋势具有较高贡献。

图2 三个温度环境下各死亡时间点光谱数据PCA结果

图3 大鼠死后48h和72h光谱数据

2.3 温度对PLS回归模型的影响

分别利用4℃、20℃和30℃组光谱数据建立死亡时间推断PLS回归模型。模型结果如表1所示:4℃组模型交叉验证R2最低,为0.78,预测均方根误差最大,为20.3h;20℃组模型交叉验证R2最高,为0.95,预测均方根误差最小,为12.8h;30℃组模型交叉验证R2为0.85,交叉验证均方根误差为9.3h,但预测均方根误差较高,为17.7h。图4为20℃组光谱数据PLS回归模型(该模型性能最优)加权回归系数图,可见PLS 模型回归系数在 1641cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1404cm-1等波数附近绝对值较高。

表1 各温度组光谱数据PLS回归模型参数

图4 20℃组光谱数据PLS模型的加权回归系数图

3 讨 论

随着FTIR光谱技术及数据处理能力的发展,利用数据挖掘技术分析死后生物组织FTIR光谱变化为死亡时间推断提供了新方法。近年来,有学者利用死后组织FTIR光谱特征的时序性变化进行死亡时间推断[3,10-11],但是这些研究忽略了温度对死后组织变化及其光谱特征的影响。因此,本研究通过分析大鼠死后肾组织在不同环境温度下的FTIR光谱特征,建立死亡时间推断PLS回归模型,探索温度对模型性能的影响。

由于大鼠肾皮质组织容易发生自溶,且自溶较快,因此选其作为研究对象。此外,本研究中30℃环境下大鼠肾皮质组织液化较快,72h后不能取到有形固体组织,为避免液化组织和固体组织光谱差异所产生的误差,30℃环境下样本取到死后72h。

在PCA结果中,4℃、20℃和30℃组光谱数据在多个时间点聚类趋势明显,体现了三种温度下大鼠肾组织化学组分具有一定差异。尤其在死后48h和72h,三个温度下组织光谱数据清晰地聚为三类,为了分析这种趋势形成的原因,本研究对这两组光谱数据PCA主成分1的因子载荷进行分析。主成分因子载荷绝对值反映了数据变量对PCA样本聚类(分类)趋势的贡献,因子载荷绝对值越大则变量贡献度越高。结果显示:主成分 1 载荷因子在 1640cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1404cm-1等波数附近绝对值较高,在1200~900cm-1范围内普遍较低。根据文献[11-12]报道:1 640 cm-1和1 537cm-1附近分别是酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ结构蛋白吸收峰;1404cm-1和1579cm-1附近分别是对称和非对称COO-吸收峰,源于氨基酸和脂肪酸;1200~900cm-1范围内以糖类等碳水化合物吸收峰为主。该结果与文献报道[5,11-12]结果一致,表明在 4℃、20℃和 30℃环境下,大鼠肾组织光谱差异主要是由组织中蛋白质、脂质以及核酸等物质组分的变化引起,而糖类等碳水化合物特征对PCA贡献值较低。

关于组织分解过程,有研究[13-15]发现,机体死亡数分钟后组织中蛋白质、脂质和核酸等物质在自身释放的酶作用下开始分解。DAVIDO等[16]研究了15℃、22℃和29℃环境下死后大鼠组织分解情况,发现温度越高其体内酶活性越高,尸体体质量损失越快,掩盖尸体土壤中的碳量与微生物呼吸作用产生的碳量增长越快。关于RNA的分解,有研究[17-18]发现,随死亡时间延长,不同环境温度下RNA完整性和含量变化完全不同:低温[(4±2)℃]环境中 RNA 含量较高,且完整性较好;高温环境[(25±2)℃、(35±2)℃]中 RNA含量和完整性降低。说明由于不同温度下死后组织内酶的活性,以及微生物繁殖演替速度和种类的不同,使组织中的蛋白质、脂质和核酸等组分的分解出现明显差异。

PLS是非常有效的数据挖掘工具,被广泛应用于食品、化工和生物等领域[19-20]。近来有法医学者利用PLS算法分析死后组织FTIR光谱数据并建立了死亡时间推断PLS回归模型[10-11],为死亡时间推断提供了新的鉴定方法和研究思路,但是这些研究未考虑环境温度等因素对组织的影响。VASCONCELOS等[21]通过分析不同温度下腐败鸡肉的FTIR光谱,发现不同温度(3℃、8℃和30℃)下鸡肉组织光谱数据的PLS回归模型性能差异较大。同样,本研究也发现不同温度组光谱数据PLS回归模型性能不同。首先,PLS回归模型交叉验证R2是最能体现模型拟合度的参数,其中 4℃组 R2最低,为 0.78,20℃组 R2最高,为 0.95;其次,4℃组PLS回归模型误差在三个温度组中最大;最后,需要注意的是,30℃组模型预测均方根误差(17.7h)远高于交叉验证均方根误差(9.3h),而 20℃组预测均方根误差和交叉验证均方根误差相近,说明20℃组模型稳定性更好。综上可以认为,本研究中20℃组PLS回归模型性能最优,推测30℃和4℃环境下死后大鼠肾组织FTIR光谱特征变化规律可能较20℃组更为复杂,因此在后续利用组织FTIR光谱数据建立死亡时间推断PLS回归模型时有必要考虑尸体环境温度因素。

在PLS回归分析中,加权回归系数绝对值反映了变量对PLS回归的贡献度。对于20℃组PLS模型加权回归系数在 1641cm-1(酰胺Ⅰ)、1579cm-1(非对称COO-)、1537cm-1(酰胺Ⅱ)和 1404cm-1(对称 COO-)等波数附近绝对值较高,即这些变量对PLS回归分析贡献较大,结果和主成分1因子载荷值基本一致,说明不同温度下死后大鼠肾组织光谱变化主要与大鼠肾组织中蛋白质、脂质以及核酸等物质组分的变化有关。

本研究借助计算机软件和数据挖掘技术解析FTIR光谱信息,分析不同温度下大鼠肾组织光谱特征差异,建立死亡时间推断PLS回归模型,并比较不同温度组PLS回归模型性能。但是,目前关于温度与尸体分解关系的系统性研究相对较少,本研究主要参照各领域关于不同环境温度下组织分解的研究[14-15,21],以及法医学鉴定实践中常见的低温(4℃左右)、常温(20℃左右)和高温(30℃左右)尸体环境,选取了具有代表性的三个温度组作为初步研究目标,发现不同温度下各死亡时间点光谱特征变化具有一定的规律。但在鉴定实践中,尸体周围环境更加复杂多变,需要在后续研究中增加人工控制温度、土壤特性以及环境湿度等影响因素[22],以获取更全面的数据,结合先进的红外光谱及数据挖掘技术建立可靠的数学模型,提高死亡时间推断的准确性。

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