人类内源性逆转录病毒囊膜蛋白Syncytin互作蛋白质筛选

井敏敏,司徒健文,陶 瑞,2,范 欣,2,井申荣,孙 鹥,2*

(1.昆明理工大学医学院,中国云南昆明650500；2.云南省第一人民医院检验科,中国云南昆明650032)

Syncytin是人类内源性逆转录病毒W1(human endogenous retrovirus W1,HERVW1)的一种包膜蛋白,由HERVW1的env基因编码。Syncytin在孕早期定位于绒毛膜滋养层,在胎儿发育过程中起重要作用,其异常表达可导致宫内发育迟缓、病理性胚胎、肿瘤和多发性硬化症等[1]。此外,syncytin的异常表达与生殖系统恶性肿瘤、淋巴细胞瘤、黑色素瘤、先兆子痫、溶血-肝酶升高-血小板减少(hemolysis,elevated liver enzymes and low platelets,HELLP)综合征等也具有相关性[1,2]。

Syncytin介导细胞融合后,细胞骨架发生重大变化,这些变化将激活p53和p16-pRB这两条肿瘤抑制途径[3,4]。在这两条途径中,存在一种响应细胞骨架变化的中心体蛋白质,即大肿瘤抑制物2(large tumor suppressor 2,LATS2),其在有丝分裂纺锤体损坏或癌基因激活的细胞中特异性表达。LATS2可转移到细胞核并激活p53,诱导多倍体细胞死亡或衰老[5]。

目前,调控syncytin表达的蛋白质还不完全清楚[6]。为了寻找细胞中与syncytin具有相互作用的蛋白质,本实验在细菌平台展开研究,通过构建原核表达载体Syncytin-pKT25及pUT18C载体所插入的人全血基因组文库,实施细菌水平的筛选,结果显示筛选到与syncytin有相互作用的短肽SJ-1。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞和质粒

大肠埃希氏菌DH5α、DHM1及BTH101报告菌均由昆明理工大学病原微生物与免疫学实验室保存；人胚胎肾细胞293T为昆明理工大学病原微生物与免疫学实验室保存；原核表达质粒pUT18C、pKT25及包含syncytin编码基因的质粒264为本实验室保存。

1.2 诱饵质粒Syncytin-pKT25的构建及鉴定

以实验室保存的含syncytin全长编码基因的真核表达载体264为模板,使用Taq DNA聚合酶扩增syncytin编码基因。引物为syncytin-F:AACTGCAGGGATGGCCCTCCCTTATCATATTTTTC,syncytin-R:GCTCTAGAACTGCTTCCTGCTGAATTGG。PCR扩增条件:94℃3 min；94℃30 s,52℃ 45 s,72℃ 2 min,35个循环；72℃ 5 min。PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测,并使用琼脂糖凝胶小量回收试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)进行回收。回收产物使用Pst I和Xba I双酶切切出黏性末端,pKT25载体使用Pst I和Xba I分步单酶切获得pKT25线性化载体,使用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,将连接产物转化至DH5a感受态细胞中,挑取单菌落进行摇瓶培养。使用质粒小量提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)抽提质粒,取1 μg的质粒用Pst I和Xba I双酶切鉴定重组的诱饵质粒。

分别将质粒pKT25和Syncytin-pKT25转化DH5a感受态细胞,涂布于卡那霉素(Kan)抗性的LB固体平板上。37℃培养16 h后,各挑取1个大小类似的单菌落接种于5 mL含50 μg/mL Kan的LB液体培养基中,37℃摇瓶培养过夜。将菌液按体积分数10%转接至含50 μg/mL Kan的LB液体培养基后继续摇瓶培养,分不同时间取样检测OD595,并绘制生长曲线。

将pKT25和Syncytin-pKT25转化DHM1的感受态细胞,随后将菌液避光涂布在含50 μg/mL Kan的M63固体平板上。30℃培养箱中避光培养。每天观察菌落颜色变化情况。

1.3 人全血基因组文库的构建及鉴定

取健康人全血样品2 mL,在4℃条件下6 000 r/min离心10 min后轻轻吸弃血清部分。在血浆中加入10倍体积10 mmol/L的PBS,轻柔吹打混匀,4℃、6 000 r/min离心5 min后轻轻吸弃上清部分。往沉淀中加入10倍体积的红细胞裂解液,4℃、12 000 r/min离心5 min后轻轻吸弃上清部分。再往沉淀中加入1 mL红细胞裂解液,37℃水浴裂解3 h。加入等体积的饱和酚,轻柔吹打混匀,4℃、12 000 r/min离心5 min,将上清转移至另一干净的离心管中,再次加入等体积的饱和酚,离心后将上清转移至另一干净的离心管中。加入等体积氯仿,第2次抽提杂蛋白。加入等体积异丙醇和1/10体积3 mol/L的NaAc溶液,上下颠倒混匀,直至出现白色絮状沉淀。4℃、12 000 r/min离心15 min后弃上清。用预冷的体积分数为70%和100%的乙醇依次漂洗沉淀一次,室温晾干。100 μL TE洗脱后,每管加入2 μL的RNA酶,37℃消化20 min即得健康人全血基因组。取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。

将获得的健康人全血基因组稀释至100 ng/μL。用SaU3A I酶切1 μg基因组约3 h,随后采用琼脂糖凝胶电泳检测其分布情况,使用小量琼脂糖凝胶回收试剂盒回收范围在500～1 000 bp之间的条带。使用BamH I酶切1 μg pUT18C质粒约1 h。将所得的线性化pUT18C载体与回收的500～1 000 bp之间的条带按照5︰1比例混合,使用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中。将转化产物涂布在氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体平板上,37℃培养16 h后随机挑取平板上的单菌落进行PCR鉴定。引物为pUT18C-F:CGCCGGATGTACTGGAAACG和pUT18C-R:GCTTAACTATGCGGCATCAG。PCR扩增条件:94℃3 min；94℃30 s,52℃30 s,72℃30 s,35个循环；72℃5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 细菌双杂交筛选与syncytin具有相互作用的蛋白质

取诱饵质粒(Syncytin-pKT25)和文库质粒(全血基因组碎片-pUT18C)各100 ng混合均匀,同时将质粒pKT25和pUT18C混匀设置为阴性对照；质粒pKT25-Zip和pUT18C-Zip混匀设置为阳性对照。三组分别转化DHM1的感受态细胞,涂布至含 25 μg/mL Kan 和 50 μg/mL Amp 的 M63 固体平板上。避光条件下,将培养板置于30℃培养箱中培养,每日观察菌落情况。在阳性对照组变蓝而阴性对照组仍为白色时,转至2～8℃避光保存备用。将蓝色菌落重新划至含25 μg/mL Kan和50 μg/mL Amp的M63固体平板上,选取出形态规整、蓝色正常且无杂色、生长速度快的单菌落重复三代。再在含50 μg/mL Amp的M63固体平板上进行三代划线,以分出形态规整、蓝色正常且无杂色、生长速度快的与诱饵质粒有相互作用的文库单菌落。对文库单菌落进一步扩大培养,送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序分析。将有相互作用的基因序列命名为:SJ-1,氨基酸序列命名为:SJ-1。

1.5 回复杂交验证SJ-1与syncytin的相互作用

1.5.1 互作质粒SJ-1-pUT18C的构建及鉴定

以1.4测序结果中含目的基因SJ-1的菌液为模板,使用Taq DNA聚合酶扩增SJ-1基因,引物为SJ-1-F:GGGGTACCGGATCGTTTCGGCCCCAAGAC和SJ-1-R:CGGAATTCGAGGATAGCTGGCGCTCTCGC。PCR扩增条件:94℃ 3 min；94℃10 s,52℃10 s,72℃10 s,35个循环；72℃5 min。PCR产物使用琼脂糖凝胶小量回收试剂盒进行回收。回收产物和pUT18C载体分别使用Kpn I和EcoR I进行单酶切。加入酶切后的载体和片段各100 ng,T4 DNA连接酶连接后,将连接产物转化至DH5α感受态细胞。使用Kpn I和EcoR I双酶切来鉴定重组的互作质粒SJ-1-pUT18C,酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5.2 回复杂交验证

取质粒Syncytin-pKT25和SJ-1-pUT18C各100 ng混合均匀,同时将质粒pKT25和pUT18C混匀设置为阴性对照,质粒pKT25-Zip和pUT18CZip混匀设置为阳性对照。三组分别转化DHM1的感受态细胞,涂布至含25 μg/mL Kan和50 μg/mL Amp的M63固体平板上。避光条件下,将培养板置于30℃培养箱中培养,每日观察菌落情况。在阳性对照组变蓝而阴性对照组仍为白色时,判定实验组的相互作用。

1.6 Co-IP验证SJ-1与syncytin的相互作用

1.6.1 真核表达载体SJ-1-pcDNA3.1-2HA的构建及鉴定

以1.4测序结果中含目的基因SJ-1的菌液为模板,使用Taq DNA聚合酶扩增SJ-1基因,引物为SJ-1-HA-F:GGGGTACCACAATGGGAGATCGTTTCGGCCCCAAGAC和SJ-1-HA-R:CCGCTCGAGGGATAGCTGGCGCTCTCGC。PCR扩增条件:94℃ 3 min；94℃ 10 s,52℃ 10 s,72℃10 s,35个循环；72℃5 min。PCR产物使用琼脂糖凝胶小量回收试剂盒进行回收。回收产物和pcDNA3.1-2HA载体分别使用Kpn I和Xho I进行单酶切。加入载体和片段各100 ng,T4 DNA连接酶连接后,将连接产物转化至DH5α感受态细胞。使用Kpn I和Xho I双酶切来鉴定重组的质粒SJ-1-pcDNA3.1-2HA。酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6.2 真核表达载体Syncytin-pcDNA3.1-2Flag的构建及鉴定

以实验室保存的含syncytin编码基因的真核表达载体264为模板,使用Taq DNA聚合酶扩增syncytin编码基因,引物为syncytin-F:AACTGCAGGGATGGCCCTCCCTTATCATATTTTTC和syncytin-R:GCTCTAGAACTGCTTCCTGCTGAATTGG。PCR扩增条件:94℃3 min；94℃30 s,52℃45 s,72℃ 2 min,35个循环；72℃ 5 min。PCR回收产物和pcDNA3.1-2Flag载体分别使用BamH I和Xho I进行单酶切。加入酶切后的载体和片段各100 ng,使用T4 DNA连接酶进行连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞。使用BamH I和Xho I双酶切来鉴定重组质粒Syncytin-pcDNA3.1-2Flag,酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6.3 Syncytin和SJ-1真核表达载体共转染

在超净工作台上,使用转染试剂PEI(上海生物工程股份有限公司)将1.6.1和1.6.2质粒共转染293T细胞。转染后继续培养约60 h。随后弃去多余培养液,加入1 mL的NP-40裂解液,轻轻吹打使细胞完全从瓶壁脱落下来,并将细胞悬浮液收集至另一干净的离心管中。将离心管置于冰水浴中裂解30 min,每隔10 min轻轻摇晃一次,使之充分裂解。留样100～200 μL用于后续Westernblot检测中的Input使用。取样品1mL,加入1.5 mL的EP管中,共两管。静音混合器上轻摇10～15 min使之裂解混匀。每管加入2 μg的mouse-IgG(上海生工生物工程股份有限公司),继续轻摇混合过夜。加入10 μL的磁珠(Abcam公司,英国),继续轻摇混合约8 h。混合结束后,将EP管置于磁力吸附架上,上清被移至另一干净的EP管中备用,磁力架吸附的沉淀则使用NP-40裂解原液清洗5次,最后一次留40 μL,-80℃冻存备用。一管上清中加入2～3 μg的mouse-anti-HA,另一管上清中加入 2～3 μg的 mouse-anti-Flag(上海生工生物工程股份有限公司),轻摇混合过夜。加入10 μL的磁珠,继续轻摇混合约8 h。将EP管置于磁力吸附架上,上清被移至另一干净的EP管中,-80℃冻存备用；沉淀则使用NP-40裂解原液清洗5次,最后一次留40 μL,-80℃冻存备用。

1.6.4 Western-blot检测syncytin与SJ-1的相互作用

使用BCA蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)对蛋白质样品进行定量。将1.6.3中收获的蛋白质样品取出,室温化冻后取20 μg,加入5×loading buffer,轻轻混匀后沸水浴20 min。将制备好的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后转移蛋白质至PVDF膜,使用10 mmol/L PBS溶液配制的10%脱脂奶粉作为封闭液,4℃封闭过夜。取出封闭好的PVDF膜,在syncytin蛋白预期大小的位置依次标记一抗mouse-anti-Flag(Abcam公司,英国)、二抗goat-anti-mouse(Abcam公司,英国)；SJ-1蛋白预期大小的位置依次标记一抗mouse-anti-HA(Abcam公司,英国)、二抗goat-anti-mouse(Abcam公司,英国)。暗室显影,并对医用X光胶片显色结果进行分析。

2 结果

2.1 诱饵质粒Syncytin-pKT25的构建

琼脂糖凝胶电泳结果显示:PCR扩增出约1 617 bp的syncytin编码基因特异性条带(图1A)。重组质粒Syncytin-pKT25经Pst I和Xba I双酶切鉴定后的结果如图1B所示,可见大小约1 617 bp的目的基因片段和大小约3 442 bp的pKT25载体骨架。利用软件DNAMAN 8.0比对测序后拼接结果与预期结果,发现两者一致,无突变,无缺失(图1C)。将质粒 pKT25和Syncytin-pKT25转化DH5α感受态细胞后,涂布于Kan抗性的LB固体平板。平板观察结果显示:两组菌落均完整,形态光滑,生长状态良好,生长曲线趋势一致(图2)。将Syncytin-pKT25转化报告菌株DHM1后,实验组在第4天仍是白色单菌,确定其无自激活效应(图 3)。

图1 诱饵质粒Syncytin-pKT25的构建(A)琼脂糖凝胶电泳检测syncytin编码基因的PCR扩增产物。M:DNA marker DL5000,泳道1:PCR扩增的syncytin编码基因产物；(B)重组诱饵质粒双酶切后的电泳检测图。M:DNA marker DL5000,泳道 1:Syncytin-pKT25经 Pst I和Xba I双酶切后的产物；(C)测序结果与预期Syncytin-pKT25序列的比对。1:标准的syncytin编码基因序列,2:PCR产物测序结果,3:标准序列与PCR产物序列的比对结果。两者的总体相似度为38.46%,红色方框表示syncytin编码基因序列区域完全相似。Fig.1 The construction of the bait plasmid SyncytinpKT25(A)Analysis of target gene with agarose gel electrophoresis.M:DNA marker DL5000.Lane 1:PCR product of target gene；(B)Identification of the Syncytin-pKT25 by restriction analysis.M:DNA marker DL5000.Lane 1:Syncytin-pKT25 was digested by Pst I and Xba I；(C)Sequence alignment.1:The standard sequence of the target gene.2:The sequence of the PCR product.3:Comparison results.The overall similarity was 38.46%,and the syncytin sequence region was completely similar.

2.2 人全血基因组文库的构建

人全血基因组的琼脂糖凝胶电泳结果见图4A。SaU3A I酶切基因组的结果显示,主要的基因组碎片集中在300～1 500 bp之间,且分散均匀(图4B)。将pUT18C线性化载体与人全血基因组条带进行连接转化处理,并对转化结果进行菌落PCR鉴定,以分析随机插入载体pUT18C的人全血基因组的条带大小及分布情况。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示:插入条带主要集中在300～1 500 bp,这与基因组酶切结果一致,且插入片段分散均匀,重复率低(图4C)。

图2 诱饵质粒Syncytin-pKT25的毒性验证(A)pKT25转入DH5α后的菌落形态；(B)Syncytin-pKT25转入DH5α后的菌落形态；(C)含pKT25和Syncytin-pKT25质粒的DH5a的生长曲线。Fig.2 The toxicity assay of the bait plasmid(A)The colonial morphology of DH5α harboring pKT25；(B)The colonial morphology of DH5α harboring Syncytin-pKT25；(C)The colonial growth curves of DH5α harboring the pKT25 and Syncytin-pKT25,respectively.

图3 诱饵质粒Syncytin-pKT25的自激活验证(A)包含诱饵质粒Syncytin-pKT25的报告菌株DHM1第1天的菌落形态；(B)包含诱饵质粒Syncytin-pKT25的报告菌株DHM1第4天的菌落形态。Fig.3 The self-activation assay of the bait plasmid(A)The colonial morphology of DHM1 containing the bait plasmid on the first day；(B)The colonial morphology of DHM1 containing bait plasmid on the fourth day.

2.3 相互作用蛋白质的细菌双杂交筛选结果

图4 人全血基因组文库构建及鉴定结果图(A)人全血基因组的凝胶电泳图。泳道1和2:抽提的人全血基因组；(B)人全血基因组经SaU3A I酶切后的凝胶电泳图。M:DNA marker DL2000,Lane 1:人全血基因组经SaU3A I酶切3 h后的产物；(C)PCR验证文库载体插入片段的凝胶电泳图。Lane 1:阴性对照,M:DNA marker DL2000,Lane 2～7:随机挑取的6个单克隆PCR扩增结果。Fig.4 The construction and identification of human blood genomic library(A)Gel electrophoresis analysis of human blood genome.Lanes 1 and 2:The genome from human blood；(B)Human blood genome digested by SaU3A I for 3 hours.M:DNA marker DL2000.Lane 1:Human blood genome digested by SaU3A I；(C)The PCR products of the genomic library inserts.Lane 1:Negative control.M:DNA marker DL2000.Lanes 2～7:PCR amplification of six randomly selected monoclones.

实验组、阴性对照组和阳性对照组分别转化DHM1的感受态细胞后,涂布至含Kan和Amp的M63固体平板上。避光条件下,将培养板置于30℃培养箱中培养至第4天时:阳性对照组90%以上变成了蓝斑(图5A)；阴性对照组几乎都是白色单菌(图5B)；共转Syncytin-pKT25和文库质粒的实验组有90%为蓝色单菌,约10%为白色单菌落(图5C、5D)。对蓝斑进行回复杂交、划线、纯化后,接种至含50 μg/mL Amp的LB液体培养基中进行扩大培养及质粒的抽提和测序分析,共得到20个阳性克隆。通过对测序结果进行序列分析及所编码的氨基酸分析,发现所有克隆插入片段的终止密码子前均有93 bp碱基编码的31个氨基酸序列,如图6的蓝色标记区所示。将这93个碱基命名为:SJ-1,其编码的蛋白质命名为SJ-1,蓝色区域为插入片段(图6)。

2.4 Co-IP验证SJ-1与syncytin的相互作用

图5 蓝白斑筛选结果(A)阳性对照；(B)阴性对照；(C)和(D)实验组。Fig.5 The results of white-blue plaque selection(A)Positive control；(B)Negative control；(C)and(D)The experimental groups.

图6 筛选所得文库质粒的测序结果蓝色标记区为191～221,表示文库质粒筛选的互作基因的31个氨基酸序列,其对应的93个核苷酸序列为572～664。Fig.6 Sequence analysis of the screened library plasmidBlue stained region is the sequence of 31 animo acids(aa 191～221)from the library plasmid,the corresponding nucleotide sequence is 572～664 nt.

使用BamH I和Xho I双酶切鉴定重组质粒Syncytin-pcDNA3.1-2Flag,酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图7A所示,可见1 617 bp的syncytin编码基因片段和大小约5 470 bp的pcDNA3.1-2Flag载体骨架。使用Kpn I和Xho I双酶切鉴定重组质粒SJ-1-pcDNA3.1-2HA,酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果如7B所示,可见93 bp的SJ-1基因片段和大小约5 470 bp的pcDNA3.1-2HA载体骨架。两种质粒共转染293T细胞后,Co-IP产物的Western-blot体外检测结果发现:两者在细胞中确实存在相互作用(图7C)。

3 讨论

筛选与syncytin有相互作用的蛋白质可为基于syncytin研制抗肿瘤药物并建立合适的药物筛选模型提供科学依据。与酵母双杂交系统相比,细菌双杂交作为一种新型的互作蛋白质筛选系统,在某些方面有其独特的优势:第一,大肠杆菌生长快,缩短了筛选周期,而且遗传操作(如质粒转化和质粒纯化)相对容易；第二,具有相对更高的转化效率,可达到109CFU/μg DNA,是酵母双杂交转化效率的1 000倍,同时能够筛选更大的文库；第三,诱饵蛋白和靶蛋白不含核定位信号,而且在研究真核生物相互作用时,诱饵蛋白和靶蛋白跟细菌蛋白质的同源性更低。

在文库质粒构建过程中,第一次手工法抽提全血基因组,-20℃过夜保存后,基因组几乎完全降解,这可能是因为所抽提的基因组中有未去除干净的DNA酶。随后,我们重新抽提,在增加一次去蛋白质过程后,基因组降解速度明显降低。在基因组酶切过程中,我们使用的是细菌基因组酶切的条件,但是在实验过程中发现,与syncytin编码基因具有相互作用的基因片段均偏小,这可能是因为细菌基因组的酶切条件不适用于全血基因组,故在后续的重复或验证实验中,可以稍微降低酶量,缩短时间。

在进行细菌双杂交时,诱饵质粒的自激活及毒性验证是至关重要的一个环节,一旦诱饵质粒存在毒性或自激活效应,将直接导致错误的筛选结果[7]。文中有关诱饵质粒的自激活验证结果显示,转入诱饵质粒Syncytin-pKT25第4天,出现不明显的浅蓝色,说明在细菌双杂交的过程中,最佳的培养时间为3～4 d,不宜太久。

图7 Co-IP验证结果(A)重组质粒Syncytin-pcDNA3.1-2Flag的酶切鉴定电泳图。M:DNA marker DL2000；泳道1:Syncytin-pcDNA3.1-2Flag原始质粒,泳道2:BamH I和Xho I双酶切质粒Syncytin-pcDNA3.1-2Flag；(B)重组质粒SJ-1-pcDNA3.1-2HA的酶切鉴定电泳图。M:DNA marker DL5000,泳道1:SJ-1-pcDNA3.1-2HA原始质粒,泳道2:Kpn I和Xho I双酶切质粒SJ-1-pcDNA3.1-2HA；(C)Co-IP在293T细胞中验证syncytin与SJ-1的相互作用。Fig.7 The Co-IP results(A)The gel electrophoresis result of reconstructed plasmid Syncytin-pcDNA3.1-2Flag,which was identified by enzyme digestion.M:DNA marker DL2000.Lane 1:Syncytin-pcDNA3.1-2Flag plasmid.Lane 2:Syncytin-pcDNA3.1-2Flag digested by BamH I and Xho I；(B)The gel electrophoresis analysis of reconstructed plasmid SJ-1-pcDNA3.1-2HA identified by enzyme digestion.M:DNA marker DL5000.Lane 1:SJ-1-pcDNA3.1-2HA plasmid.Lane 2:SJ-1-pcDNA3.1-2HA digested by Kpn I and Xho I；(C)Detection of interaction between SJ-1 and syncytin by Co-IP in 293T cells.