生物信息学预测lncRNA DLEU1的功能及其在膀胱癌中调控ncRNA代谢途径的作用

何富强,付军明,郭君其,朱凌峰

(福建医科大学福州总医院泌尿外科,中国福建福州350025)

膀胱的主要生理功能是通过输尿管将肾脏收集到的尿液进行储存,并通过尿道从体内排出。膀胱癌的发生与膀胱细胞的异常生长密切相关。该疾病是一种世界范围内常见的癌症,在男性和女性恶性肿瘤的死亡率中分别位列第四位和第十位,且表现出比其他恶性肿瘤更高的复发率[1]。膀胱癌分为移行细胞癌(约占病例的90%)、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤或小细胞癌(约占病例的10%)等5种类型[2],主要症状包括无痛性毛细血管瘤、血尿、膀胱刺激症状、骨盆或骨性疼痛、下肢水肿或侧面疼痛等[3]。目前,膀胱癌发生的机制尚未完全阐明,因此选择多种生物信息学手段作为本研究的研究方法,旨在阐明淋巴细胞白血病缺失基因1(deleted in lymphocytic leukemia 1,DLEU1)的功能及其在膀胱癌发展过程中的重要作用。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc-RNA)是长度超过200个核苷酸,且不编码蛋白质的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),参与诸如胚胎发育[4]、细胞生长[5]、基因转录调控[6]等各种生理病理过程。lncRNA的异常表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关[7],已被作为胃癌、肝癌等肿瘤生存和复发的生物诊断标志物[8,9]。膀胱癌中研究最广泛的 lncRNA 包括 H19[10]、MALAT1[11]、UCA1[12]、HOTAIR[13]和 MEG3[14]。其中,H19、MALAT1和HOTAIR与膀胱癌复发或转移风险的增加显著相关[15]；UCA1与膀胱癌的分级和分期显著关联。

在B细胞慢性淋巴细胞白血病中,较频繁的细胞遗传学突变就是染色体13q14的缺失,提示在该基因座处存在可能的抑癌基因[16]。Tyazhelova等[17]通过载体构建、数据库搜索和缺失作图等方式,在13q14上的10 kb区域内克隆出淋巴细胞白血病缺失基因DLEU1和DLEU2。后续研究表明,DLEU1参与Burkitt淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生发展过程[18,19]。DLEU1在膀胱癌中的生物学功能尚未被研究。在此,我们首次采用GO分析、信号通路富集分析等生物信息学方法,综合探讨DLEU1的基本生物学功能,并进一步揭示DLEU1在膀胱癌进展过程中相关的信号转导通路。

1 材料与方法

综合利用Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology[20](http://atlasgeneticsoncology.org/)、Dcode[21](www.dcode.org)、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、GWAS Catalog[22](www.ebi.ac.uk/gwas/)、Open Target Platform[23](www.targetvalidation.org)、HPA RNA-seq[24]、FireBrowse[25](http://firebrowse.org)、Wanderer[26](http://maplab.imppc.org/wanderer/)、GEPIA[27](http://gepia.cancer-pku.cn/)、Multi Experiment Matrix[28](http://biit.cs.ut.ee/mem)、Linked-Omics[29](http://www.linkedomics.org)和Metascape[30](http://metascape.org)等生物信息学工具对lncRNA DLEU1的功能及其在膀胱癌中的作用和信号转导机制进行全面的分析,并得出相应的结果。

2 结果

2.1 人DLEU1基因染色体定位及转录本分析

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology数据显示,人DLEU1基因定位于13q14.2～q14.3,具体坐标为(GRCh38):13:50 082 168～50 528 643,全长 641.89 kb(图 1)。基因组序列分析进一步发现DLEU1和DLEU2相距约300 bp,以头对头的方式排列,并以相反的方向转录。DLEU1主要可以转录成3个转录本:NR_002605(2个外显子)、NR_109973(3个外显子)和NR_109974(7个外显子)。

2.2 人DLEU1物种保守性分析

在进化生物学中,不同物种间核酸(DNA或RNA)、蛋白质中的高度保守序列是经自然选择不断优化筛选幸存下来的,提示该序列在物种进化中可能发挥重要功能。目前,保守序列的鉴定通常采用基于序列比对的生物信息学方法。图2为ECR Browser比对结果,图中最顶端为DLEU1基因外显子和内含子的基因注释；下面依次为小鼠、大鼠、狗、牛、恒河猴和黑猩猩DLEU1基因组与人DLEU1基因组的比对图,每个峰代表基因组中序列相似性高的高度保守区域,其中黄色区域代表基因非编码区,绿色区域代表转座子和短重复序列,橙色区域代表内含子。结果显示,与6个其他脊椎动物基因组相比,人DLEU1基因中存在多个峰值高的区域,提示这些区域高度保守,可能发挥着重要的生物学功能。

2.3 人DLEU1在多种正常组织中的表达分析

为了明确DLEU1的功能,首先需要明确DLEU1在不同组织中的表达情况。利用HPA RNA-seq方法对 95名个体来源的27种正常组织进行测序,分析DLEU1 RNA的表达变化(项目号:PRJEB4337)。结果发现,DLEU1广泛表达于多种器官中,在睾丸、结肠、皮肤、肾脏等组织中高表达,同时在膀胱组织中也有较高表达(图3),提示该基因可能在多种器官生理和病理过程中发挥特定的作用。

图1 人DLEU1基因染色体定位及转录本分析Fig.1 Chromosomal location and transcript analysis of human DLEU1 gene

图2 通过ECR Browser比对人类基因组与6个其他脊椎动物基因组中DLEU1基因的保守性Fig.2 Alignment of the conserved DLEU1 between human and other six vertebrate species by ECR Browser

2.4 DLEU1的生物学功能

图3 DLEU1广泛表达于人正常组织中Fig.3 DLEU1 is widely expressed in human normal tissues

Targetvalidation主要基于基因组关联分析和文本挖掘分析基因的功能。为了明确DLEU1的基本生物学功能,我们在Targetvalidation上键入DLEU1,结果发现,DLEU1与肿瘤(卵巢癌、白血病、急性骨髓性白血病、胃癌、前列腺癌、Burkitt淋巴瘤、乳腺癌等)、多发性硬化症乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化等疾病密切相关,且还参与身高的调控,涵盖生殖系统、消化系统、免疫系统、造血系统、内分泌系统等,具有广泛的生物学功能(图4)。

GWAS Catalog是NHGRI-EBI旗下对已发表的基因进行全基因组关联研究的网站。我们通过该网站进一步分析发现,与Targetvalidation得出的结果类似,位列前六位的表型包括身高、PSA检测、主动脉根部大小、体重指数、臀围、原发性胆汁性肝硬化(表1)。此外,乳腺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤也位列其中。以上信息提示DLEU1与多种肿瘤的发生发展密切相关。

2.5 DLEU1在多种肿瘤中的表达

Firebrowse Gene Expression Viewer可对肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据进行基因表达情况的分析。在该网站中键入DLEU1,结果发现,DLEU1在膀胱癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、胃癌(STAD)、肺癌(LUAD)等绝大多数肿瘤中均呈高表达(与正常对照相比)(图5)。此结果与DLEU1生物学功能分析结果一致,表明DLEU1可能参与膀胱癌的发生发展过程。

2.6 DLEU1在膀胱癌中的表达及其与临床预后的关系

Wanderer是主要用于探索人类癌症中DNA甲基化和基因表达水平的数据分析平台。具体的分析步骤如下:样本类型选择膀胱上皮细胞癌,数据类型选择Illumina Hiseq RNAseq,Adjust P value threshold选择P＜0.05。结果发现,与19例癌旁正常组织相比,DLEU1在267例膀胱癌患者中显著性高表达(P＜0.05,图6A)。GEPIA是由北京大学开发的用于分析TCGA和GTEx项目中9 736个肿瘤和8 587个正常样本的RNA测序表达数据,提供肿瘤/正常差异表达、癌症类型或病理分期、患者生存分析等结果。进一步的生存分析结果显示,DLEU1的高表达与膀胱癌患者整体生存率和无病生存率的降低显著相关(P=1.9E-05；4.4E-05,图6B),提示DLEU1可能作为癌基因参与膀胱癌的发生发展进程。

2.7 多种肿瘤芯片中与DLEU1共表达的基因及其KEGG富集、PPI分析

图4 通过Targetvalidation预测与DLEU1基因相关的疾病Fig.4 The diseases associated with DLEU1 predicted by Targetvalidation

表1 GWAS Catalog全基因组关联分析与DLEU1基因相关的表型Table 1 Phenotypes associated with DLEU1 by GWAS analysis

图5 DLEU1在多种TCGA肿瘤中的表达Fig.5 The expression of DLEU1 in several TCGA tumor samples

为了探究DLEU1在不同肿瘤进程中所参与的共同信号转导通路,我们采用MEM(Multi Experiment Matrix)平台针对100个与肿瘤表达相关的芯片进行DLEU1的共表达基因分析,得到与DLEU1共表达的前200个基因列表(图7A)。将得到的基因输入Metascape进行GO信号通路富集分析和PPI蛋白质互作分析。结果表明,在众多肿瘤芯片中,DLEU1可能与细胞周期、线粒体分裂、DNA复制、DNA完整性检查点、微管骨架蛋白组装、ncRNA代谢等细胞生物学功能相关 (图7B)。PPI网络分析进一步表明,DLEU1可能与细胞周期等过程密切相关。具体结果如图7C所示,其中MCODE_1代表有丝分裂纺锤体检查点；MCODE_2代表核糖体生物合成；MCODE_3代表DNA同源重组；MCODE_4代表线粒体转录；MCODE_5代表snRNA转录。

2.8 DLEU1在TCGA-BLCA中的共表达基因及其KEGG富集、PPI分析

图6 DLEU1的表达与膀胱癌患者生存预后的关系(A)DLEU1在TCGA-BLCA中的表达分析；(B)DLEU1高表达与膀胱癌患者预后呈负相关。Fig.6 The expression of DLEU1 and survival analysis in TCGA-BLCA samples(A)Expression analysis of DLEU1 in TCGA-BLCA；(B)High expression of DLEU1 is negatively correlated with prognosis of patients with bladder cancer.

为了探究DLEU1在膀胱癌进程中所参与的信号转导通路,我们采用LinkedOmics对TCGABLCA进行DLEU1的共表达差异分析(图8A),得到与DLEU1共表达的正相关和负相关的基因列表,并将得到的前200名正相关基因输入Metascape,进行GO信号通路富集分析和PPI蛋白质互作分析。结果表明,在TCGA-BLCA肿瘤样本中,DLEU1可能与ncRNA代谢途径、碳代谢、ncRNA转录等细胞生物学功能正相关(图8B)。PPI网络分析表明,DLEU1可能与ncRNA代谢途径等相关过程关系密切,具体结果如图8C所示,其中MCODE_1代表rRNA代谢；MCODE_2代表rRNA修饰；MCODE_3代表mRNA剪接；MCODE_4代表pre-mRNA加工；MCODE_5代表snRNA转录。结合DLEU1在多种肿瘤中的共同通路,我们可以发现,DLEU1极有可能通过ncRNA代谢途径参与膀胱癌的发展过程。

3 讨论

膀胱癌是男性中第四大最常被诊断出的癌症。超过70%的膀胱癌患者被诊断为非肌层浸润性疾病。然而,膀胱肿瘤接受膀胱内化疗(22%)或卡介苗的生物治疗(29%)后,50%～70%的病例会出现复发,10%～20%的病例会侵入固有肌层(T2或更高)[31]。对于肌肉浸润性疾病,治疗方案十分有限。膀胱切除术和化疗联合放疗是两种最常见的治疗选择,但长期预后较差,5年生存率仅为47%。对于合并的所有阶段,膀胱癌患者预期5年生存率为77%,10年生存率为70%。高复发和进展速率快是膀胱癌治疗的主要障碍[32]。确定膀胱癌的新检测和治疗靶点对于开发进一步有效的监测和治疗至关重要。

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子。越来越多的证据表明,lncRNA通过介导靶基因转录在心血管疾病、自身免疫性疾病、神经变性疾病和癌症等各种疾病中发挥重要的调节作用。因此,了解膀胱癌中lncRNA的机制可能有助于寻找膀胱癌的有效治疗方法。以前的研究表明,包括 MALAT-1、H19、UCA1 在内的许多lncRNA通过调节细胞增殖和迁移而参与膀胱癌的发生发展过程。DLEU1是一种在B细胞淋巴瘤等造血系统肿瘤中经常缺失的潜在发挥抑癌作用的lncRNA分子。研究表明,DLEU1通过与miR-490-3p相互作用改变CDK1的表达进而促进卵巢癌的发生和发展[19]；在胃癌中,DLEU1通过表观遗传学调控机制抑制KLF2的表达进而促进细胞增殖,并可用于预测胃癌的不良预后[18]。然而,DLEU1在膀胱癌中的作用仍不清楚。

图7 DLEU1在100种肿瘤芯片中的共表达基因及其KEGG富集和PPI网络分析(A)肿瘤表达芯片中DLEU1的共表达基因热图；(B)前200名DLEU1共表达基因的KEGG分析；(C)前200名DLEU1共表达基因的PPI分析。Fig.7 DLEU1 co-expressed genes and their KEGG enrichment and PPI analysis in 100 tumor arrays(A)The heatmap of top 200 DLEU1 co-expressed genes in tumor expression chips；(B)KEGG analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes；(C)PPI analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes.

图8 DLEU1在TCGA-BLCA中的共表达基因及其KEGG富集和PPI网络分析(A)LinkedOmics中DLEU1的共表达基因热图；(B)KEGG分析LinkedOmics中前200名的DLEU1共表达基因；(C)PPI分析LinkedOmics中前200名的DLEU1共表达基因。Fig.8 DLEU1 co-expressed genes and their KEGG enrichment and PPI analysis in TCGA-BLCA(A)The heatmap of DLEU1 co-expressed genes in TCGA-BLCA samples；(B)KEGG analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes in LinkedOmics；(C)PPI analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes in LinkedOmics.

本研究采用Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology、Dcode、NCBI、GWAS Catalog[22]、Targetvalidation、FireBrowse、Wanderer、GEPIA、Multi Experiment Matrix、LinkedOmics和Metascape等多种可视化生物信息学手段,系统全面地研究了DLEU1的染色体定位、物种保守性、多种正常和肿瘤组织中的表达变化、GWAS相关表型,并重点研究了其在膀胱癌中的表达、预后、信号转导网络等。通过Multi Experiment Matrix和LinkedOmics的联合分析发现,DLEU1极有可能通过调控ncRNA代谢途径参与膀胱癌的发生发展过程。需要特别指出的是,以上分析均基于生物信息学预测,具有一定的实验指导意义,但仍需后续开展实验进行验证。

综上所述,本研究通过多种生物信息学手段发现,DLEU1在膀胱癌中高表达,且与其总体生存率和无病生存率的显著降低相关,对于后续深入研究DLEU1对膀胱癌的调控作用机制有很强的指导意义。

声明：该研究无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。