高效液相色谱法测定清热解毒分散片中绿原酸含量

吴建明，丁京伟，赵 准，朱 婷，叶志学，沈汉福，沈彩虹

（浙江维康药业股份有限公司，浙江 丽水 323000）

清热解毒分散片为复方中成药，其配方起源于清热解毒片，由生石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、甜地丁、黄芩、龙胆、板蓝根、知母、麦冬12味中药组方，功能主治为清热解毒，用于治疗流感、上呼吸道感染及各种发热性疾病[1]。分散片是指在水中能迅速崩解并均匀分散的片剂[2]，中药分散片同时具备液体制剂和固体制剂的独特优势，分散度大，溶出迅速，生物利用度高，服用方式多样化，制备方法简单易行，是一种应用前景广阔的中药口服新剂型[3]。金银花为方中君药，具有清热解毒、疏散风热之功效。绿原酸类化合物如绿原酸和异绿原酸是金银花的主要有效成分，绿原酸为其主要活性成分之一[4]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法测定金银花中绿原酸含量，进一步对清热解毒分散片进行质量控制[5]221。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括G1311A泵、G1329A进样器、G1314B检测器、G1316A柱温箱（美国安捷伦公司）；BS124S型电子分析天平（检测精度为0．1‰，德国赛多利斯股份有限公司）；KQ－500DB型超声波清洗器（功率为500 W，昆山市超声仪器有限公司）。

1．2 试药

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，质量分数以 99．3%计，批号为 110753－201716）；清热解毒分散片（浙江维康药业股份有限公司，批号分别为B161201，B161202，B161203）；甲醇（色谱纯，批号为164488，纯度为 99．9% ），乙腈（色谱纯，批号为1606018，纯度为99．9%），均购于赛默飞世尔科技有限公司；甲醇（分析纯，批号为20151216，国药集团化学试剂有限公司，纯度不低于99．5%）；水为纯化水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Agilent SB －C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 0．4% 磷酸（10 ∶90）；柱温：30 ℃；检测波长：327 nm；流速：1 mL／min。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000。

2．2 溶液制备

对照品溶液：取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取 1．0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，弃初滤液，取续滤液，再用微孔滤膜（0．45 μm）滤过，即得。

阴性对照品溶液：取按样品制备工艺制备的缺金银花阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2．3 方法学考察

专属性试验：取 2．2项下 3种溶液各 10 μL，进样测定。结果阴性对照品溶液在对照品溶液及供试品溶液色谱峰相应位置无绿原酸峰出现，阴性对照无干扰，表明专属性良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含绿原酸0．07 mg的溶液，摇匀，作为对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10，14 μL，按拟订色谱条件进行分析，测定峰面积。以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝2×106X －10 383，r＝0．999 9（n＝6）。结果表明，绿原酸进样量在 0．14 ～ 0．98 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，连续进样5次。结果绿原酸面积的 RSD为0．29%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，16 h时进样测定。结果绿原酸含量的 RSD为0．28%（n＝5），表明供试品溶液在16 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为B161201）样品5份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果绿原酸平均含量为每片 1．55 mg，RSD 为 1．60%（n＝5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取6份已知含量的样品（批号为 B161201）约 0．5 g，分别加入绿原酸对照品溶液0．8，1．0，1．2 mL，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 绿原酸加样回收试验结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取清热解毒分散片3批，依法检测。结果批号分别为B161201，B161202，B161203的3批样品中绿原酸含量分别为每片 1．55，1．57，1．64 mg。

3 讨论

3．1 色谱柱选择

曾选择3种不同厂家的色谱柱Agilent SB－C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），YMC －ODS 分析柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Phenomenex－ C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm），考察了方法的耐用性，分离度、理论板数均能满足系统适用性试验的要求。综合对称因子等各种因素，选择 Agilent SB － C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）为色谱柱。

3．2 检测波长选择

对绿原酸进行紫外扫描（200～600 nm），发现绿原酸在327 nm波长处有最大吸收，且吸收强度适宜，其他组分响应值相对较小，结合文献[6－7]，选择327 nm作为检测波长。

3．3 流动相选择

绿原酸为含有羟基和邻二酚羟基的强极性有机酸[8]，溶于水后有部分解离，容易发生主峰拖尾、重复性差等现象，因此需在流动相中加入一定比例的酸，能抑制酸解离，有助于提高主峰与干扰峰的分离度，改善峰形[9－10]。试验选用甲醇 －水 －甲酸（30∶70 ∶0．2）和乙腈 －0．4%磷酸（10∶90）为流动相，对流动相不同组分和比例进行调节，让其能排除其他成分的干扰，绿原酸保留时间和峰形都适宜，最后选定流动相为乙腈－0．4%磷酸(10∶90)。

3．4 提取溶剂选择

绿原酸易溶于醇、水，难溶于氯仿、乙醚。试验分别考察乙醇、甲醇、50%甲醇提取溶剂，超声提取、加热回流提取方法及20，30，40 min超声提取时间对结果的影响，结果30 min后测定值达到稳定值，超声提取和回流提取所提取出的绿原酸含量结果非常接近，但超声提取比回流提取更简便快捷。由于样品溶液中成分相对复杂，用50%甲醇方法提取效果较好，提取比较完全，而且杂质峰相对较少。故基于操作简便等各方面考虑，以50%甲醇为提取溶剂，超声处理30 min即可[11－12]。

3．5 质控指标选择

清热解毒分散片是一种新型现代化中药剂型，2015年版《中国药典（一部）》收载了清热解毒口服液和清热解毒片，清热解毒口服液质量标准对黄芩苷进行了含量测定[5]1552，清热解毒片质量标准对黄芩苷和栀子苷2种成分进行了含量测定[5]1553，但未对组方中的其他组分进行含量测定。考虑到清热解毒分散片方中金银花的用量和功效远远高于黄芩和栀子，绿原酸为金银花中的主要活性成分之一，对绿原酸含量的测定能直接反映药品质量，确保疗效，控制产品质量。且不同厂家生产的品种中绿原酸的含量会存在一定差异，故本试验以绿原酸为质控指标[13－15]。