不同质量浓度脂多糖对人肺上皮细胞活性的影响*

姜晓芳，陈 霞，杨 艳，冯 静

（中国人民解放军第324医院儿科，重庆 400020）

急性肺损伤（ALI）可以由严重感染、创伤等多种因素导致，临床常见为急性进行性加重的呼吸困难和难以纠正的低氧血症[1]。虽然国内外学者致力于ALI的防治研究已有多年，但发病率仍居高不下，病死率高达30% ～40%[2]。目前，ALI的细胞模型建立最多见的是采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导[3]，但诱导浓度以及细胞模型建立成功的标准并不统一，使用的LPS诱导浓度相差可达10倍以上，导致研究的标准不易掌握。基于此，本研究中通过采用不同质量浓度LPS诱导肺上皮细胞，观察细胞活性的变化，为ALI相关细胞实验提供参考。

1 材料与方法

1．1 试剂、材料与仪器

LPS(Sigma，L2880)；CCK －8 试剂盒（日本同仁）；细胞培养瓶（Corning公司）；特级胎牛血清（GIBCO）；细胞培养板（NEST）；人肺上皮细胞株（A549，南京科佰生物科技有限公司）。ReverTra Ace－a－二步法RT－PCR KIT（日本东洋纺）；超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）；CO2细胞培养箱（Thermo Scientific）；倒置显微镜（Leica公司）。

1．2 方法

用不同质量浓度 LPS（0．050，0．100，0．125，0．250，0．500，1．000，5．000，10．000，50．000，100．000 μg ／mL）刺激人肺上皮细胞建立ALI细胞模型，48 h后应用CCK－8试验检测不同质量浓度的LPS对人肺上皮细胞的活性的影响。采用宝生物公司RNAiso Plus提取细胞总 RNA，然后采用宝生物公司 SYBR．Premix Ex TaqTMII进行实时定量PCR反应，引物序列如下。

细胞间黏附分子－1(ICAM－1)F － 5′GCCCGAGCTCAAGTGTCTAA 3′R － 5′GGAGAGCACATTCACGGTCA3′

1．3 统计学处理

绘图及数据分析使用Excel和SPSS 17．0统计软件完成。计量资料以s表示，两组独立样本采用 t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 LPS诱导肺上皮细胞48 h后细胞活性的变化

不同质量浓度LPS刺激人肺上皮细胞48 h，结果见图1。可见，10 μg／mL LPS即可诱导肺上皮细胞活性明显下降，与 5 μg／mL LPS比较差异显著（P ＝0．020 6＜0．05）。当LPS质量浓度为10～50 μg／mL时，细胞活性处于平台期，差异不显著，但高于50 μg／mL时肺上皮细胞活性再次出现明显下降，与100 μg／mL LPS比较有显著差异（P ＝0．040 8＜0．05）。

图1 不同质量浓度LPS诱导肺上皮细胞48 h后细胞活性变化

2．2 LPS刺激人肺上皮细胞的细胞形态变化

结果见图2。当 LPS质量浓度高于50 μg／mL时，肺上皮细胞坏死比较明显；当LPS质量浓度低于10 μg／mL时，肺上皮细胞形态无明显变化。

图2 光镜下不同质量浓度LPS诱导A549细胞形态(×100)

2．3 LPS诱导肺上皮细胞48hICAM－1mRNA表达量

LPS 质量浓度为 0，5，10，50，100，200 μg／mL 时，诱导肺上皮细胞48 h ICAM－1 mRNA表达量分别为1，(5．5 ± 1．4)，(12．5 ± 7．8)，(23．7 ± 7．5)，(25．8 ± 5．1)，(28．5 ±9．4)μg／mL。其中 10，50 μg／mL 时 A549 细胞ICAM－1 mRNA表达量与 5 μg／mL LPS比较有显著升高（P ＝ 0．016 9，0．005 ＜ 0．05）。

3 讨论

ALI模型是研究ALI／急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发病机制、有效疗法的重要实验手段[4]，病理特征可表现为肺微血管和肺泡上皮损伤、肺毛细血管通透性增加等。现国内外已成功建立创伤性、放射性、内毒素性多种肺损伤模型，但最经典模型为LPS诱导的ALI细胞或动物模型。LPS是革兰阴性菌细胞壁中的一种成分，对宿主有害，可引起发热、白细胞反应、内毒素血症等。LPS引起的全身败血症是ALI／ARDS的常见病因，在许多ALI患者的肺组织中，无论有无细菌感染，都能检测到革兰阴性菌内毒素LPS的存在[5－6]。

目前，关于ALI动物模型建立的标准和方法已较成熟，如腹腔注射LPS、气管滴注LPS及尾静脉注射LPS是典型的原发性或继发性ALI模型，也称为间接或直接ALI模型[7－9]。但尚无 ALI细胞模型建立的标准。发生ALI时，主要病理学特征表现为上皮细胞损伤和中性粒细胞等炎性细胞浸润和渗透性肺水肿的形成[10]。故国内外现大多采用LPS直接诱导肺上皮细胞，观察细胞活性及细胞因子水平的变化[11]，特别是肺上皮细胞的凋亡，可诱导大量肺上皮细胞丢失，促发ALI的进展[12]。CCK－8法是检测细胞增殖／毒性的常见试验[13－14]。ICAM－1是参与许多炎症性疾病的重要病理生理基础，是ALI发生、发展的关键分子标志[15－16]。

本研究中发现，应用不同质量浓度LPS刺激人肺上皮细胞48 h后，10 μg／mL LPS即可诱导肺上皮细胞活性明显下降（P＜0．05），但细胞坏死不明显。LPS质量浓度高于50 μg／mL时，肺上皮细胞活性持续下降，但细胞坏死比较明显。建议LPS实验质量浓度控制在10～50 μg／mL为宜。本研究中对 LPS诱导后的肺上皮细胞代表性炎性因子 ICAM－1 mRNA测定发现，LPS质量浓度为10 μg／mL时，ICAM－1 mRNA表达量与5 μg／mL LPS有显著差异；但 LPS质量浓度高于50 μg／mL 时，如 100 μg／mL 时 ICAM －1 mRNA 表达量与50 μg／mL比较无显著差异。进一步提示LPS质量浓度控制在10～50 μg／mL对ALI细胞模型的意义。

本研究中为建立ALI细胞模型的标准提供了较准确的基础实验依据，但由于细胞株及LPS来源不同可能会存在一定浓度差异。在下一步研究中，课题组也将继续寻找能更加准确反映ALI的发生和发展过程的细胞病理学或免疫学变化指标。