乳腺癌患者血清PPAR⁃γ基因甲基化qPCR检测及临床意义

韦美德 董家书 周格琛 邓开凤 戴盛明

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性身心健康［1］。自20世纪70年代末开始，乳腺癌在全球范围内一直位居女性肿瘤的首位，并且其发病率还在以每年1.2%的速度递增，我国新确诊乳腺癌患者占新发癌症患者的25%［2⁃3］。乳腺癌发生发展过程中，抑癌基因甲基化异常是导致疾病发生的重要机制，其可成为肿瘤筛查与诊断有价值的生物标志物［4⁃5］。研究表明，肿瘤患者外周血中循环DNA的浓度明显增加，肿瘤细胞来源的循环游离 DNA（circulating cell⁃free DNA，cfDNA）常携带肿瘤相关的遗传异常如超甲基化，这一特点促使cfDNA有可能成为潜在的生物标志物，因其具有获取简便，侵害性小，实时监测等优势，可为肿瘤的早期诊断，预后评估提供有效依据［6］。过氧化物酶体增殖物激活受体⁃γ（peroxisome proliferator⁃acti⁃vated receptor⁃γ，PPAR⁃γ）是一种由配体激活的核转录因子，活化的PPAR⁃γ可调控脂肪细胞相关基因的表达，具有抗肥胖及抗炎抗肿瘤作用［7⁃8］。本课题组前期的实验结果表明PPAR⁃γ在乳腺癌组织表达低于癌旁组织［9］，研究已证实，PPAR⁃γ低表达与该基因的启动子甲基化增加有关［10］。PPAR⁃γ基因甲基化状态在乳腺癌中尚未见报道，本研究拟通过进一步检测乳腺癌患者血清中PPAR⁃γ基因甲基化状况，结合临床病理资料，探讨PPAR⁃γ基因甲基化检测在乳腺癌筛查与诊断方面的应用价值，为PPAR⁃γ甲基化检测在临床中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2015年4月至2016年9月在我院就诊的良、恶性乳腺疾病患者共343例作为研究对象（患者临床资料完整），乳腺癌153例，年龄范围27～75岁，平均年龄（41.7±8.1）岁；乳腺囊肿66例，年龄范围24～66岁，平均年龄（35.7±6.9）岁；乳腺增生 124例，年龄范围22～61岁，平均年龄（32.7±6.9）岁；所有乳腺癌患者术前未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗，良性乳腺疾病患者未进行手术及药物治疗；健康对照女性50例，年龄范围25～65岁，平均年龄（35.7±5.5）岁。4组资料在年龄上比较差异无统计学意义（P＞0.05）。研究获得伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 标本的采集与储存

清晨空腹采集研究对象全血，置于生化无抗凝剂管，避免溶血。常温静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，将血清转移至聚丙烯EP管中，将所有标本统一编码，保存于-80℃低温冰箱备用。收集乳腺癌患者临床信息。

1.3 试剂和引物

血清DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Midi Kit，货号51185），重亚硫酸氢盐修饰试剂盒（EpiTect Fast DNA Bisulfite Conversion Kit，货号59824）购自德国凯杰生物技术（上海）有限公司；PCR 试剂（Talent qPCR PreMix，货号 FP209⁃02）购自天根生化有限公司；甲基化阳性对照（Cp⁃GenomeTM Universal Methylated DNA）和甲基化阴性对照（CpGenome Universal Unmethylated DNA）购自美国Millipore公司。根据人源PPAR⁃γ基因启动子序列，由大连宝生物有限公司设计合成甲基化特异引物和非甲基化引物（表1）。

1.4 血清DNA提取与重亚硫酸氢盐转化修饰

根据按照QIAamp DNA Blood Mini Kit操作说明书提取每样品1 mL血清基因组DNA，经NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度。按照Epi⁃Tect Fast DNA Bisulfite Kit说明书对提取的DNA样品和标准品DNA（CpGenomeTM Universal Methylated DNA和CpGenome Universal Unmethyl⁃ated DNA）进行重亚硫酸氢盐转化修饰。

表1 引物序列Table 1 Details of primers

1.5 标准品的制备和标准曲线的建立

NanoDrop 2000测定重亚硫酸氢盐转化修饰后的甲基化阳性对照DNA浓度和纯度，以双蒸水按10倍梯度稀释制作浓度依次为1 500、150、15、1.5、0.15、0.015 ng/μL的DNA标准品，按每拷贝基因组DNA约3 pg计算，分别加入2 μL标准品，则相当于106～10的拷贝数，以不同浓度阳性对照标准品扩增获得的循环值（cycle threshold，CT）为横坐标（x轴），标准品拷贝数的对数值为纵坐标（y轴）制作标准曲线，该标准曲线的制备参考文献［11⁃12］进行。

1.6 实时荧光定量 PCR（real⁃time fluorescent quantive PCR，qPCR）检测 PPAR⁃γ基因甲基化情况

分别检测每一个样品的甲基化情况，PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，40个循环；72℃继续延伸10 min后，进行熔解曲线分析以确认产物的特异性。每次实验以CpGenome Universal Unmethyl⁃ated DNA为阴性对照。根据样品CT值，结合标准曲线分别计算样品的甲基化和非甲基化拷贝数，甲基化水平=甲基化拷贝数/（甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数）。甲基化引物出现扩增则认为该样品为甲基化阳性标本。

1.7 统计学处理

所有数据均使用Graph⁃Pad Prism 5.0进行统计，以P＜0.05认为差异有统计学意义。PPAR⁃γ甲基化检出率与临床病理特征间的关系用卡方检验分析；各疾病组甲基化水平的比较用Wilcoxon秩和检验。

2 结果

2.1 标准曲线制备结果

甲基化标准品浓度分别为 106、105、104、103、102、10拷贝时，PPAR⁃γ的CT 值分别为 19.6、22.8、25.3、27.9、31.2、34.8，标准曲线相关系数为 0.995，样品甲基化和非甲基化拷贝数计算公式为：拷贝数=10(-0.335×CT值+12.54)，见图 1。

图1 PPAR⁃γ检测标准曲线Figure 1 The standard curve of PPAR⁃γdetection

2.2 各组样本PPAR⁃γ基因甲基化水平

各组乳腺疾病PPAR⁃γ基因甲基化水平分别为：乳腺癌（32.3%～50.2%）；乳腺囊肿（27.7%～44.9%）；乳腺增生（25.6%～42.5%），与健康对照（23.2%～30.6%）进行秩和检验，差异均有统计学意义（P＜0.05），而疾病组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 乳腺疾病患者PPAR⁃γ甲基化检出率的比较

乳腺疾病患者血清DNA中PPAR⁃γ甲基化检出率分别为：乳腺癌54.9%（84/153），乳腺囊肿45.5%（30/66），乳腺增生41.1%（51/124），均显著高于对照组的16%（8/50），差异均有统计学意义（P＜0.05）（表3），乳腺癌检出率与乳腺囊肿无差异，但与乳腺增生差异显著（P＜0.05）；153例乳腺癌患者PPAR⁃γ基因甲基化检出率与患者年龄、分期、病理类型以及淋巴结转移均无显著差异（P＞0.05），见表4。

表2 各组样本PPAR⁃γ基因甲基化水平Table 2 The level of PPAR⁃γgene methylation in different group

表3 乳腺疾病样本与正常对照样本PPAR⁃γ甲基化检出率Table 3 The detection rate of PPAR⁃γmethylation in breast disease samples and normal control samples

3 讨论

表4 乳腺癌患者临床资料及PPAR⁃γ甲基化检出率Table 4 The clinical data of breast cancer patients and the detection rate of PPAR⁃γmethylation

血清游离DNA可来源于肿瘤细胞溶解或微转移灶排出［13］，因此循环DNA检测对某些肿瘤的早期诊断、监测复发、判断肿瘤的活动性有重要价值。DNA甲基化是表观遗传学修饰的方式之一，抑癌基因甲基化导致基因失活和转录抑制，引起细胞代谢紊乱，是肿瘤发生的重要机制之一［14］。相关研究表明乳腺癌血清中多种关键抑癌基因的表达缺失都与其CpG岛高甲基化有关［15］。PPAR⁃γ是核受体基因超家族中的一员，通过配体依赖途径影响下游基因转录［16］。PPAR⁃γ在脂肪组织、结肠、脾脏及巨噬细胞中大量表达，并且被认为可通过调控细胞周期而影响肿瘤生长［17⁃18］。有报道称PPAR⁃γ与雌激素反应元件结合后，可阻止雌激素反应元件和雌激素受体结合，从而抑制雌激素活性，成为临床治疗雌激素依赖性疾病的一种重要途径［19］。越来越多的体内及体外实验证据表明PPAR⁃γ参与抗炎反应［15］，并且细胞内PPAR⁃γ的表达对调节性T细胞的抗炎作用是必须的［20］。另外，Apostoli等［21］利用PPAR⁃γ敲除试验，发现PPAR⁃γ激活显著降低了二甲基苯丙蒽介导的恶性乳腺肿瘤体积，且不考虑基因型；Abduljabbar等［22］研究发现高表达的PPAR⁃γ与没有接受激素治疗的雌激素受体阳性肿瘤患者的生存期延长有关，提示PPAR⁃γ的激活和表达很可能起到控制肿瘤生长的作用。本课题组前期实验结果发现PPAR⁃γ在癌组织中低表达，研究已证实，PPAR⁃γ低表达与该基因的启动子甲基化增加有关［10］。Sharma等［23］认为血浆游离DNA和原发性乳腺癌肿瘤标本中存在较为一致的表观遗传学改变，在乳腺癌的监测与预后判断中具有潜在价值。检测游离DNA的各种生物学特性有可能用于肿瘤患者的无创性诊断。关于血清还是血浆用于肿瘤基因检测目前有不同的讨论。Takeshita等［24］认为血浆的检测敏感性更高。Park等［25］则认为，虽然血浆中的游离DNA浓度范围相比血清大，但血清游离DNA含量在癌症组和正常组之间也有明显差异，从血清检测DNA亦可。另外，血清提取样本DNA比血浆更稳定，有利于增加检测反应的灵敏性和稳定性［26］。综合以上因素，本研究拟选用无抗凝剂的血清作为检测样本。

目前在乳腺癌中已报道的异常基因甲基化有结肠腺瘤样息肉（adenomatous polyposis coli，APC）基因、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptbili⁃ty gene 1，BRCA1）、人类RUNT相关转录因子3（human runt⁃related transcription factor 3，RUNX3）、张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolo⁃gy deleted on chromosome ten，PTEN）等［27⁃29］，为DNA甲基化用于乳腺癌的筛查与诊断提供了重要依据。本研究评估了乳腺癌患者血清PPAR⁃γ基因甲基化状态，进而分析PPAR⁃γ基因甲基化检测在乳腺癌筛查与诊断的意义。结果显示，乳腺癌患者血清中PPAR⁃γ基因甲基化检出率明显高于乳腺增生患者以及健康对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05），而与乳腺囊肿无显著差异，并且疾病组PPAR⁃γ基因甲基化检出率都显著高于健康对照组（P＜0.01），表明PPAR⁃γ基因甲基化在疾病人群中的发生率增加；PPAR⁃γ基因甲基化检出率与乳腺癌患者年龄，临床分期，病理类型以及淋巴结转移无相关性；另外，疾病组PPAR⁃γ基因甲基化水平无差异（P＜0.05），但都显著高于健康对照组（P＜0.05），乳腺癌组PPAR⁃γ基因甲基化水平可显著区分健康对照人群，但不能与乳腺良性疾病区分开，说明PPAR⁃γ甲基化水平增高提示人群存在罹患乳腺疾病的可能。

本研究通过荧光定量检测方法发现乳腺癌血清中PPAR⁃γ基因甲基化水平增高，在乳腺癌筛查和诊断中具有一定的临床应用前景，待进一步扩大临床样本检测，以提供更准确的分子生物学依据。