异鼠李素对糖尿病大鼠心肌纤维化的干预作用

白 跳， 迟丽屹， 高宇勤， 胡小菁

(1西安市第九医院老年病一科， 西安 710054； 2解放军第四五一医院神经内科， 西安 710054；3西安市第九医院心血管内科， 西安 710054)

糖尿病与心力衰竭风险增加有关，这类心脏疾病不依赖于高血压和潜在的冠心病，称为糖尿病心肌病[1]。糖尿病性心肌病的特征在于功能和结构性心脏变化，包括心肌细胞凋亡和细胞外基质蛋白的积聚[2]，其中心肌纤维化是糖尿病心肌病心脏变化最常见的机制[2-3]。慢性高血糖可增加炎症相关细胞因子如转化生长因子β(TGF-β)的水平，从而参与心肌纤维化的发展[4]。虽然慢性高血糖在糖尿病并发症的发病机制中起着重要作用，但是心肌纤维化的分子机制尚不清楚。

中药提取物如葡萄制品中的多酚，最近因其对心肌的保护作用而引起相当大的关注[5]。其中，异鼠李素(分子式：C16H12O7)是一种从中药中分离出的黄酮苷元，在传统医学中可用于预防和治疗多种疾病，已发现其具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等保护作用[6]。据报道，异鼠李素可以保护大鼠心室肌细胞免受缺血和再灌注损伤[7]。在Ⅱ型糖尿病大鼠模型中，异鼠李素能够抑制肾脏氧化应激并减少炎性介质的产生[8]。同时已有文献报道，异鼠李素可通过抑制TGF-β/Smad信号通路减轻肝脏纤维化和氧化应激[9]。因此，本研究拟探讨异鼠李素对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化和TGF-β/Smad信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1动物与药物雄性Wistar大鼠30只，体质量约为170～210 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供,异鼠李素由美国Sigma公司提供。

1.2主要试剂链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)，胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和胶原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)抗体(美国Abcam公司)，β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)，转化生长因子-β(TGF-β)和SMAD蛋白2/3(Smad 2/3)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，马森(Masson)三色染色试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物公司，丙二醛(MDA)试剂盒购自南京凯基公司。

1.3实验分组及实验方案雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病组和异鼠李素组，每组10只。参照文献[10]建立大鼠糖尿病模型。整个实验过程中，对照组大鼠予以普通饲料喂养，糖尿病组和异鼠李素组大鼠以高糖高脂饲料(含10%猪油、20%蔗糖，70%常规饲料)。喂养8 w后，糖尿病组和异鼠李素组大鼠腹腔单次注射溶于枸橼酸钠缓冲溶液链脲佐菌素(45 mg/kg)，对照组大鼠仅腹腔注入等量的枸橼酸缓冲溶液。链脲佐菌素或单纯枸橼酸缓冲溶液腹腔注射后72 h于大鼠尾静脉采血，采用Roche公司血糖检测仪测量大鼠血糖浓度，判定大鼠空腹血糖浓度>11.6 mmol/L为糖尿病大鼠模型建立。此后，行4 w的药物治疗，异鼠李素组大鼠每日口饲生理盐水溶解的异鼠李素(30 mg/kg)，糖尿病组和对照组每日口饲等体积生理盐水。已有文献报道异鼠李素(30 mg/kg)可有效抑制肝脏TGF-β/Smad信号通路从而减轻肝纤维化[9]，故参照该文献,本研究采用异鼠李素(30 mg/kg)治疗4 w,以观察异鼠李素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响。

1.4血清生化指标检测药物治疗结束后，以戊巴比妥钠(50 mg/kg)过量麻醉处死大鼠并行下腔静脉取血，检测空腹血糖浓度并收集血清，使用酶法测得血清甘油三酯和总胆固醇的含量。

1.5Masson染色各组取5只大鼠，麻醉后打开胸腔,完整分离取出心脏，反复冲洗后将心脏组织置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，包埋为石蜡组织块后切成厚度为5 μm的切片。参照Masson染色试制盒说明书行心脏Masson三色染色，观察心肌组织中胶原纤维的含量。Masson染色后以95%酒精和二甲苯行充分脱水透明，封片后于光学显微镜下检测。每个样本随机选择5个镜下低倍视野框(×100)，镜下胶原纤维呈蓝色，肌肉呈红色。计算每个视野的心肌胶原纤维面积与心肌总面积比值，记为心肌纤维化面积比值。

1.6Westernblot蛋白分子检测各组取5只大鼠，用于Western blot检测和氧化应激水平检测。Western blot蛋白分子检测时，称取心肌组织约200 mg，剪碎后加入裂解液充分裂解，参考蛋白厂家说明书操作步骤提取心肌组织总蛋白。采用BCA法测定各样本蛋白总含量后，用等量蛋白样本行聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用5%脱脂牛奶封闭约30 min。用特定浓度一抗(抗Collagen Ⅰ抗体，1∶1 000；抗Collagen Ⅲ抗体，1∶750；抗TGF-β抗体，1∶1 000；抗Smad 2/3抗体，1∶1 000；抗β-actin抗体，1∶400)与PVDF膜4℃孵育过夜。加入HRP标记山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗室温下孵育2 h，行ECL显色。

1.7氧化应激水平检测通过检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量反应心肌氧化应激水平。取心肌组织约100 mg，与10倍重量的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7.4)充分匀浆。收集的匀浆上清产物根据试剂盒厂家说明书以分光光度计法测定SOD和MDA值。

2 结果

2.1异鼠李素对大鼠代谢及生化指标的影响与对照组比较，糖尿病组大鼠体质量减轻，但空腹血糖值和血清甘油三酯、总胆固醇含量明显增加(P<0.05)。与糖尿病组比较，异鼠李素组大鼠出现体质量增加，空腹血糖值和血清甘油三酯、总胆固醇含量下调(P<0.05)，见表1。

表1 异鼠李素对大鼠代谢及生化指标的影响

注：与对照组比较，*P<0.05； 与糖尿病组比较，△P<0.05。

2.2异鼠李素对心肌纤维化面积的影响与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌纤维化面积比例明显增加(P<0.05)，而糖尿病组、异鼠李素组大鼠心肌纤维化面积比例明显下降(P<0.05)，见图1、图2。

图1 异鼠李素对心肌纤维化面积的影响

注:n=5, 与对照组比较，*P<0.05; 与糖尿病组比较，△P<0.05。

对照组

糖尿病组

异鼠李素组

图2对照组、糖尿病组、异鼠李素组的Masson染色病理结果

2.3异鼠李素对心肌CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达的影响与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达明显增加(P<0.05)，与糖尿病组比较，异鼠李素组大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达更低(P<0.05)，见图3。

2.4异鼠李素对心肌TGF-β和Smad2/3蛋白表达水平的影响与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表达明显增加(P<0.05)，与糖尿病组比较，异鼠李素组大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表达水平较低(P<0.05)，见图4。

图3 异鼠李素对心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响

a： 心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达结果统计图(n=5, 与对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，△P<0.05)； b： 对照组、糖尿病组、异鼠李素组的Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达结果Western blot图。

图4 异鼠李素对心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表达水平的影响

a：心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表达结果统计图(n=5, 与对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，△P<0.05)；b：对照组、糖尿病组、异鼠李素组的TGF-β和Smad 2/3蛋白表达结果Western blot图。

2.5异鼠李素对大鼠心肌氧化应激水平的影响与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌MDA含量增加(P<0.05)，而SOD活性减少(P<0.05)，与糖尿病组比较，异鼠李素组大鼠心肌MDA含量减少(P<0.05)，而SOD活性增加(P<0.05)，见表2。

表2 异鼠李素对大鼠心肌氧化应激水平的影响

注：与对照组比较，*P<0.05； 与糖尿病组比较，△P<0.05。

3 讨论

糖尿病心肌病最重要的病理特征是高血糖诱导的细胞外基质(主要是Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ)过量产生，从而改变心脏的结构和功能，导致心脏顺应性下降和心脏的收缩及舒张功能减退[11]。本研究采用高脂高糖饮食诱发胰岛素抵抗并单次注射链脲佐菌素(STZ)导致胰腺β细胞的部分功能失调的方法构建糖尿病心肌病大鼠动物模型[12]。该方法处理后大鼠出现了明显的高糖血症和高胆固醇血症，心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达增加，同时心肌Masson胶原染色发现糖尿病组大鼠心肌组织中出现胶原堆积，提示糖尿病大鼠心肌纤维化。

异鼠李素是一种从野生植物醋柳果实中提取出的黄酮苷元[6]。已有研究发现，异鼠李素可通过抑制TGF-β/Smad信号通路减轻肝脏纤维化[9]。本研究结果发现，异鼠李素可减少糖尿病组大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达，而心肌Masson染色发现异鼠李素组大鼠心肌纤维化面积明显减少，说明异鼠李素可有效地缓解糖尿病大鼠的心肌纤维化。研究证实TGF-β/Smad信号通路与糖尿病心肌病中心肌纤维化的关键信号通路[13]。心肌TGF-β可在过量血糖影响下产生增多，促使心肌组织间质中成纤维细胞激活，导致心肌纤维蛋白和胶原的合成。本研究结果显示，异鼠李素组大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3的蛋白表达水平较糖尿病组大鼠明显降低，提示异鼠李素的抗心肌纤维化作用可能和其抑制TGF-β/Smad信号通路相关。

研究表明，糖尿病所导致的心肌纤维化与氧化应激反应密切相关[1, 14]。高血糖可使机体产生大量的活性氧物，从而导致正常心肌细胞造成氧化应激损伤，并通过TGF-β等信号通路诱发细胞外基质过量生成[15]。本研究检测了心肌氧化应激相关标记物SOD和MDA的含量，结果显示糖尿病大鼠心肌抗氧化应激物质SOD活性下调而脂质过氧化物MDA释放量明显上调。大量研究表明，异鼠李素具有明显的抗氧化应激作用。本研究结果表明，异鼠李素可明显增加心肌SOD活性并减少MDA含量，提示异鼠李素对糖尿病大鼠心肌的保护作用可能与其抗氧化应激效果有关。

综上所述，本研究通过制备大鼠糖尿病心肌病模型，探讨异鼠李素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响，结果表明异鼠李素可缓解糖尿病大鼠心肌胶原蛋白聚集和纤维化进程，其可能与其抗氧化应激作用和抑制TGF-β/Smad信号通路相关。