基于1H-NMR研究罗勒总黄酮对ApoE-/-小鼠血清代谢组学的影响

阿尔祖亚·多力空， 艾尼瓦尔·吾买尔， 努尔乎玛尔·库尔班， 艾再提·克热木，阿迪力·阿不都热合曼， 邬利娅·伊明， 周文婷

(新疆医科大学药学院药理学教研室， 乌鲁木齐 830011)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种长期的、复杂的血管炎性及代谢紊乱性疾病，作为心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)最主要的病理基础，在全球范围内的发病率和死亡率呈上升和低龄化趋势，严重危害人类健康[1]。代谢组学(metabonomics)是通过考察外界刺激或干扰对生物体系内源性代谢产物的性质及其含量的变化，系统反映生物体代谢异常信息的一门新兴学科[2]。NMR核磁共振代谢组学技术基于样品前处理简单、操作简单、多重复性、样本量少等优势[3]，广泛运用于高血压[4]、高脂血症[5]、动脉粥样硬化[6]等代谢紊乱性疾病的发病机制及防治研究。罗勒(OcimumbasilicumL., OBL)为唇形科(Labiatae)植物罗勒的地上部分，具有抗血栓、降血脂、降血压、强心安神、健脾肾等作用[7]。本课题组前期研究表明罗勒具有抗氧化[8]、保护血管内皮细胞以及抑制血栓形成的作用[9-10]。本研究采用ApoE-/-小鼠饲以高脂饲料建立AS模型，并结合1H-NMR技术对其血清代谢产物变化情况进行检测分析，测定了脂代谢、糖代谢、氨基酸及能量代谢中主要代谢物的含量变化，筛选差异代谢物从而为AS发病机制及罗勒抗AS的作用机制提供科学依据，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1仪器-80℃超低温冰箱(中国海尔公司)；-20℃低温冰箱(中国海尔公司),600 MHz核磁共振波谱仪(美国Varian公司), Millipore 水纯化系统(美国Millipore 公司),低温台式超速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2试药重水(美国Cambridge isotop laboratories公司，批号：20170605)，磷酸氢二钠(天津市广复精细化工研究所，批号：20160511)，磷酸二氢钾(天津市广复精细化工研究所，批号：20160924)，乙醇(天津市福晨化学试剂厂，批号：20170108)。

1.3药材罗勒2016年9月采集于新疆吐鲁番地区托克逊县，经新疆医科大学药学院天然药物化学与生药学教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为唇形科(Labiatae)罗勒属(Ocimum L.)植物罗勒(OcimumbasilicumL.)。

1.4实验动物ApoE-/-小鼠20只，雄性，6 w龄，体质量(20±2)g。具有相同遗传背景的同周龄C57BL/6J小鼠10只。动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：NO.11400700210013，使用许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验动物饲养于新疆医科大学医学实验动物中心，SPF级，室温(20±2)℃，湿度30%～40%，自由饮水进食。

2 方法

2.1罗勒总黄酮的提取称取罗勒药材2 kg，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h。过滤除沉淀，合并提取液，回收乙醇至无醇味，得水混悬液。以1/3水混悬液体积氯仿萃取3次，得氯仿层，减压蒸干，真空干燥，得罗勒脂溶性组分。再分别以50%乙醇和95%乙醇依次洗脱，合并洗脱液。40℃减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得罗勒总黄酮组分(含量>60%)。

2.2ApoE-/-小鼠的分组及给药6 w龄雄性ApoE-/-小鼠20只，随机分为模型组(灌胃给予蒸馏水10 mL/kg体质量)和罗勒总黄酮组(灌胃给予罗勒总黄酮240 mg/kg体质量)，全过程给予高脂饲料(含1%胆固醇、0.2%猪胆盐、10%猪油、10%蛋黄粉、78.8%基础饲料)，共计14 w。6 w龄雄性C57BL/6J小鼠10只作为空白组，全过程给予普通饲料，同时灌胃给予蒸馏水(10 mL/kg体质量)。

2.3血样的收集及保存小鼠灌胃给药14 w，末次给药前禁食不禁水12 h， 给药1 h后眼眶静脉丛取血至1 mL离心管中，室温下静置1 h， 3 000 r/min离心10 min，取上清液200 μL作为血清样本，再加入400 μL磷酸缓冲溶液(将0.83 g K2HPO4、0.14g NaH2PO4及0.90 g NaCl溶于100 mL超纯蒸馏水，均匀混合配成PH为7.0的缓冲溶液)。置于4℃超低温离心机以3 000 r/min离心10 min，取上清液200 μL移至5 mm核磁管中待测。

2.4血清1H-NMR图谱测定及数据分析采用核磁共振波谱仪对小鼠血清进行1H-NMR检测，测试温度25℃，频率600 MHz，预饱和方式抑制水峰，饱和时间为2s，单次扫描时间为1.636 s，谱宽10 000 Hz，采样点数64 k，扫描次数为128次。以乳酸化学位移1.33 ppm双峰质子信号作为化学位移参考峰定标调整基线。将1H-NMR图谱在化学位移 δ 0～9.0 ppm范围内以δ 0.003 ppm积分区间进行分段积分，除去4.7～5.0 ppm之间的水峰积分值，所有积分值进行归一化处理。导入SIMCA-P+11统计软件进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和偏最小二乘判别式法分析(PLS-DA)分析。

3 结果

3.1各组小鼠血清1H-NMR图谱按“2.4”项下方法测定正常组、模型组、罗勒总黄酮组小鼠在给药14 w后血清代谢物的1H-NMR 图谱，通过1H-NMR图谱对3组小鼠血清中主要代谢物成分信号进行了归属，结果表明3组小鼠血清中主要代谢物成分包括：1.VLDL；2.异亮氨酸；3.亮氨酸；4.缬氨酸；5.异丁酸；6.β-羟丁酸；7.脂类(Lipid)；8.LDL；9.乳酸；10.丙氨酸；11.脯氨酸；12.谷氨酰胺；13.丙酮酸；14.肉碱；15.甲胺；16.柠檬酸；17.肌酸；18.胆碱；19.牛磺酸；20.β-葡萄糖；21.α-葡萄糖；22.甘氨酸；23.肌醇；24.赖氨酸。这些代谢物存在于能量、氨基酸、脂质代谢等多种生物转化过程，见图1。

图1 各组小鼠血清1H-NMR图谱

3.2各组小鼠血清代谢物图谱模式识别分析结果将1H-NMR图谱以PLS-DA和OPLS-DA方法进行模式识别分析，可得到小鼠血清代谢物1H-NMR图谱的平面散点图与3D空间分布图。在SIMCA-P+软件中，通过R2X、R2Y和Q2来表示实验过程中所建立模型的质量评价指标。其中R2是所解释的模型差异，Q2是所预测的模型差异。R2、Q2值越接近于1，代表模型拟合度越好，越小代表模型拟合度越差，一般认为模型的预测结果达到“良”的标准必须要Q2>0.4。空白组和模型组血清代谢物OPLS-DA分析结果显示，R2X=0.544， R2Y=0.983，Q2=0.922，说明两组小鼠血清代谢物成分存在差异性。平面散点图中横纵坐标表示2个主成分(坐标无单位)，每个点代表每一个样本，2组之间无交叉，无重叠，存在差异性，见图2。空白组、模型组及罗勒总黄酮组小鼠血清代谢物OPLS-DA分析结果显示，R2X=0.592， R2Y=0.845，Q2=0.667，说明3组小鼠血清代谢物成分存在差异性。3D空间分布图和平面散点图中横纵坐标表示2个主成分(坐标无单位)，每个点代表每一个样本，2组之间无交叉，无重叠，存在差异性，见图3、4。

图2 空白组和模型组小鼠血清代谢物OPLS-DA平面散点图

图3 空白组、模型组、罗勒总黄酮组小鼠血清PLS-DA分析平面散点图

图4 空白组、模型组、罗勒总黄酮组小鼠血清PLS-DA分析3D空间分布图

3.3各组小鼠血清差异性代谢物分析各组小鼠血清主要差异性代谢物有：VLDL、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异丁酸、β-羟丁酸、脂类(Lipid)、LDL、乳酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、肉碱、甲胺、柠檬酸、肌酸、胆碱、牛磺酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甘氨酸、肌醇、赖氨酸等，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠血清主要差异性代谢物及其相关系数

注：s：单峰； d:双重峰 ； t: 三重峰 ；m: 多重峰 ；dd: 双重双重峰 ；ddd；双重双重双峰；“↑↓”表示后一组较前一组浓度的升高或降低。

4 讨论

三羧酸循环是糖、蛋白质和脂肪彻底氧化分解的共同途径，研究表明三羧酸循环中间体与动脉粥样硬化有密切的相关性[11]。柠檬酸是体内三羧酸循环重要的中间产物。ApoE-/-小鼠血清柠檬酸水平降低，表明三羧酸循环过程被抑制，影响机体正常物质代谢与能量代谢。罗勒总黄酮组小鼠血清柠檬酸水平升高，表明三羧酸循环抑制有一定逆转。肌酸是机体能量储存和利用的重要化合物，并具有一定降低TC、TG、LDL的作用[12]。ApoE-/-小鼠肌酸较空白组降低，而罗勒总黄酮组小鼠血清肌酸水平升高，表明罗勒总黄酮可能具有一定增加机体能量储存和供给能力的作用。葡萄糖是机体的主要能源物质，葡萄糖无氧酵解生成ATP分为两个步骤：第一步，葡萄糖分解为丙酮酸；第二步，丙酮酸还原生成乳酸。本研究中模型组小鼠血清葡萄糖含量升高，糖异生增加，证明糖酵解过程受阻，葡萄糖代谢紊乱，而罗勒总黄酮组有明显逆转作用。丙酮酸和乳酸作为葡萄糖酵解产物在模型组小鼠血清中均有下降趋势，而罗勒总黄酮组2者水平有一定逆转。

当机体出现能量供应不足时，赖氨酸可分解为葡萄糖，提供体内所需能量；赖氨酸还可在体内转化为脂质代谢中的肉毒碱，参与能量代谢。本研究中模型组小鼠血清赖氨酸水平显著降低，罗勒总黄酮组小鼠血清赖氨酸水平升高。谷氨酰胺是体内重要抗氧化剂牛磺酸的前体，可提高机体抗氧化能力，使组织和器官的自由基损伤减少[13]。模型组小鼠血清谷氨酰胺和牛磺酸含量均减少，而罗勒总黄酮组二者含量增加，表明罗勒总黄酮可增强机体抗氧化能力，减轻自由基损伤。胶原是动脉粥样硬化斑块的主要成分，而脯氨酸是蛋白胶原的主要成分[14]。模型组小鼠血清脯氨酸水平明显升高，罗勒总黄酮组小鼠血清脯氨酸水平降低，表明罗勒总黄酮可能通过减少胶原的合成从而减少动脉粥样斑块的形成。脂质代谢方面，极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)是形成动脉粥样硬化斑块的主要原因[15]。本研究中模型组小鼠血清水平VLDL、LDL升高，罗勒总黄酮组小鼠血清VLDL、LDL水平降低。

综上所述，ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠能量、氨基酸、脂质代谢均出现不同程度的紊乱，罗勒总黄酮可能通过调节不同代谢中关键生物标志物，从而对动脉粥样硬化小鼠体内代谢紊乱起到一定调控作用，其代谢途径有待进一步研究及验证。