缺血大鼠心肌细胞晚钠电流的变化规律和阿托伐他汀的作用

李小龙，万征

（天津医科大学总医院心内科，天津300052）

临床上，急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）患者在缺血早期即可发生致死性室性心律失常[1]。目前，他汀类药物作为治疗冠状动脉性心脏病的常用药，可减少室性心律失常的发生[2-3]，但机制尚未完全明确。在缺血动物模型中室性心律失

常的发生常伴随心室肌细胞晚钠电流（INaL）增大[4]，而缺血介导的心律失常可被INaL抑制剂减轻[5]。本实验室曾报道阿托伐他汀可抑制快钠电流（INaT）异常增大，而在细胞水平上直接观察阿托伐他汀对INaL的研究尚罕见报道。本实验拟用膜片钳方法记录不同模拟缺血时间下大鼠左室心肌细胞INaL的变化规律及阿托伐他汀对该过程的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠40只，雄性，200～250g，购于中国医学科学院放射医学研究所试验动物中心。

1.2 试剂和溶液 阿托伐他汀钙购于USP公司（批号：344423-98-9）。无钙台氏液（mmol/L）：NaCl 137、KCl 5.4、MgCl21、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose10，以NaOH将pH调至7.4。KB液（mmol/L）：L-谷氨酸 50、KCl 40、MgCl23、KH2PO420、牛磺酸 20、KOH 70、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose 10，以 KOH将pH调至7.4。记录INaL的电极内液成份（mmol/L）：CsCl 140、NaCl 10、EGTA 5、HEPES 5、Na2ATP 5，以CsOH将pH调至7.3。记录INaL的正常电极外液（以下简称为正常外液）成份（mmol/L）：Choline-Cl 120、NaCl 25、CsOH 4、CaCl20.1、CoCl22、MgCl2l、HEPES l0、Glucose 10，以CsOH将pH调至7.4。记录INaL的缺血电极外液（以下简称为缺血外液）：记录INaL的正常电极外液中去除葡萄糖，加入乳酸钠（20 mmol/L）后，将pH调至6.8，使用前通入氮气5 min。将阿托伐他汀钙3.023 mg分别溶于500 mL记录INaL的正常电极外液和500 mL记录INaL的缺血电极外液中即得到正常药液和缺血药液（阿托伐他汀浓度为5 μmol/L）。酶解液：11 mg胶原酶和 13 mg BSA 溶于40 mL无钙台式液。

1.3 主要仪器设备 AXON公司产MultiClamp 700B放大器、Diadata 1440A数模转换器和pClampl0数据分析软件；SUTTER公司产MP-285R微操作器和P-97水平微电极拉制器；OLYMPUS公司产IX71研究型倒置荧光显微镜。

1.4 细胞分离 称重大鼠，腹腔注射肝素钙5000IU/kg，10min后腹腔注射水合氯醛40 mg/kg麻醉；开胸取心脏，于4℃充氧无钙台氏液中修剪；迅速将主动脉套扎在Langendorff灌流系统上；保持灌注压70cm H2O，恒温38.1℃，先以充氧无钙台氏液经主动脉根部灌流5 min，后以充氧酶解液循环灌流约30 min；待流速变快（约20 mL/min），心脏呈膨大松弛、外观橘红透明状时，停止灌流；在充氧KB液中将左室游离壁分为若干大小相当的心肌条（约10 mm×3 mm），在KB液中剪碎、吹打，使细胞散落；以200目滤网过滤后，在冰冻KB液中静置2 h，以备电生理实验。

1.5 INaL记录与实验分组 在室温（25℃）下将细胞置于正常外液中，用正常外液以3 mL/min的速度灌流3 min，冲净残留KB液及细胞碎屑。电极入液后补偿液接电位，进行高阻封接，待稳定1 min后补偿电极电容，负压吸引破膜以形成全细胞记录模式。再次稳定1 min后，进行膜电容和全细胞补偿，补偿串联电阻至75%，随机分组记录。实验共分4组，各组均先在正常外液中记录基线INaL作为对照，后依照不同实验要求，以灌流方式更换电极外液：(1)正常组灌流正常外液；（2）缺血组灌流缺血外液，使细胞进入模拟缺血状态；（3）正常-他汀组灌流正常药液，使细胞接受5 μmol/L阿托伐他汀处理；（4）缺血-他汀组灌流缺血药液，使细胞进入模拟缺血状态同时接受5 μmol/L阿托伐他汀处理。灌流3 min后继续记录INaL，每2 min记录1次，持续10 min，观察INaL随时间的变化规律。

1.6 INaL的记录程序 钳制电位-90 mV，测试电位从-80 mV开始，阶跃5 mV，逐步去极化到+50 mV，脉宽 62.5 ms，频率 2.5 Hz。

1.7 数据处理和统计学分析 对INaL进行标准化[6]，观察INaL标准化值的差异。实验数据均以表示，采用方差分析方法测定重复测量资料以观察时间依赖性及各组间差异，P＜0.05表示差异有统计学显著性意义。

2 结果

INaL的时间效应为单细胞INaL随时间变化，见图1，取-40 mV测试电压下的INaL标准化值进行分析。

2.1 组内比较 （1）正常组，基线状态和记录3、5、7、9 min等各个时间点的INaL之间并无差别（分别P＞0.05，表 1）；（2）缺血组，模拟缺血开始后，INaL先增大后减小（图 1）：①模拟缺血 3～7 min 时，INaL高于基线状态，并于3 min时达峰（表1）；②模拟缺血9min时的INaL和基线状态比较无差别（分别P＞0.05）；（3）正常-他汀组，基线状态和各个记录时间点的INaL之间并无差别（分别 P＞0.05）；（4）缺血-他汀组，与基线状态相比，INaL在模拟缺血5 min时减少0.43±0.31（P=0.035），在模拟缺血 7 min 时减少0.48±0.37（P=0.044）（表 1）。

2.2 组间比较 各组间基线INaL并无差异，（1）与正常组相比，缺血组INaL在记录3～9 min内均增大（分别 P＜0.05）；（2）与正常组相比，正常-他汀组 INaL在记录3～9min内均未发生明显变化（分别 P＞0.05）；（3）与缺血组相比，缺血-他汀组INaL在记录3～7 min时减小（分别 P＜0.05）（表 1）。

图1 单细胞INaL图Fig1 Single cell INaLfigure

表1 各组在不同记录时间下的INaL标准化值（）Tab 1 The INaLstandardized values of each group at different recording time（

表1 各组在不同记录时间下的INaL标准化值（）Tab 1 The INaLstandardized values of each group at different recording time（

F 时间=1.409，P 时间=0.265；F 区组=4.644，P 区组=0.011；F 交互=10.822；P 交互=0.000 0；与缺血组相比，*P＜0.05，ΔP＜0.01；与基线相比，#P＜0.05

基线状态n 记录时间正常组缺血组正常-他汀组缺血-他汀组7 7 8 6 1 1 1 1 P组间组别 3 m i n 0.8 2±0.2 4 Δ 1.7 9±0.6 6#0.8 8±0.2 8 Δ 0.8 3±0.4 6 Δ 0.0 0 0 5 m i n 1±0.3 6*1.4 6±0.6 6#1.0 6±0.2 3*0.7 2±0.4 5*#0.0 1 1 7 m i n 0.9 2±0.3 2 Δ 1.2 6±0.3 7#1.0 3±0.2 7*0.6 8±0.5 2*#0.0 0 7 9 m i n 1.0 3±0.3 8*1.2 2±0.3 6 0.9 4±0.1 9*0.7 4±0.5 2 0.1 6 6

3 讨论

在正常组，各记录时间点INaL标准化值与基线相比无差别，说明正常状态下单细胞INaL不会随实验时间延长而发生明显变化。

由于INaT在缺血超早期存在时间依赖性变化[8]，为了观察INaL在缺血状态下是否也存在时间依赖性变化，本实验观察了缺血10 min内INaL的变化。又因缺血损伤的程度与缺血时间有关，为观察INaL的瞬间变化，将观察时间间隔设为2min。在模拟缺血3min时，INaL出现一过性增大并达峰。而在正常状态下INaL在10 min内保持不变，说明缺血是使INaL增大的唯一因素，这与文献报道相一致[4]。INaL的增大可引起动作电位时程延长，容易引起早后除极而产生触发活动[9]；另一方面，由于缺血在时间和空间上的差异，可引起心肌动作电位2相复极离散度和各向异性增大[10-11]，从而形成折返发生的基础，因此INaL增大是缺血早期室性心律失常的重要原因之一。

INaL增大是缺血状态引起心电活动异常变化的机制之一，而临床和基础研究均表明他汀类药物具有多效性作用，抑制心脏重构、抑制神经内分泌激活等，甚至直接影响心室肌细胞膜离子通道功能，进而改善细胞生存环境、改善细胞电稳定性，从而减少室性心律失常的发生[7-9]，有一定的抗心律失常作用，因此有必要研究INaL与他汀类药物作用之间的内在联系。本实验中，正常组和正常-他汀组INaL无差别，提示5 μmol/L阿托伐他汀并未对INaL产生作用。而有研究报道，5 μmol/L阿托伐他汀可抑制大鼠左室心室肌细胞INaT和瞬时外向钾电流[6,12]。临床上，阿托伐他汀的最大用量通常为80 mg/d，而2～10 μmol/L的浓度就相当于临床上10～80 mg/d的用药剂量。本文认为常规剂量阿托伐他汀不会对正常心肌细胞的INaL产生影响。而在缺血-他汀组中，INaL在模拟缺血3 min时的一过性增大现象消失，说明5 μmol/L阿托伐他汀可以抑制模拟缺血早期INaL异常增大，起到稳定细胞电活动的作用，进而有可能降低心律失常的触发阈值，减少其发生。本文结果表明阿托伐他汀的这一作用会对急性缺血心肌诱发的室性心律失常产生有益的抑制效应，从而可能减少不良心血管事件的发生。有研究显示，增强的INaL可使细胞内Na+浓度增加，激活逆模式钠钙交换体，导致Ca2+内流增加，引发心室肌细胞钙超载，可引起晚后除极、触发活动和尖端扭转性室性心律失常[13-14]。而他汀类药物则可抑制缺血介导的氧化应激反应[15-16]，从而减少上述钙调控异常，进而抑制INaL异常增大带来的负面效应。近年来，有报道称他汀类可通过激活PI3-kinase/Akt信号通路拮抗上述缺血介导的心律失常，这或许能够成为探讨阿托伐他汀稳定INaL的途径之一[17]。