环境胁迫因子对蜡样芽孢杆菌毒力基因表达和致病性的影响

王 琰，刘金兰

(天津农学院水产学院/天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

鱼病的发生是宿主、病原和环境三者相互作用的结果。环境胁迫可以分为急性胁迫和慢性胁迫，指的是鱼类所处的生存环境产生急剧变化而对其产生刺激，从而能打破鱼类正常的生理功能，对其健康造成不利影响[9]。在鱼类养殖过程中，温度、pH值、亚硝酸盐浓度等是影响鱼体正常生长的重要胁迫因子。由于鱼类是水生变温动物，它的生长发育与水环境温度密切相关。温度不仅直接影响正常的生长发育与鱼体生理功能，而且间接制约了水体中氨氮和溶解氧等理化因子的含量[10]。pH值作为不可忽视的胁迫因子之一，过高或过低都会对鱼体产生影响[11]。亚硝酸盐浓度过高可以降低鱼体血液载氧能力，造成组织缺氧，甚至导致窒息死亡[12-14]。

研究蜡样芽孢杆菌大多集中在食品领域，在水产上相对较少，关于其毒力基因表达的研究非常缺乏。开展环境胁迫因子对细菌毒力基因表达的研究，将有助于阐明细菌的流行病规律、蜡样芽孢杆菌感染的发生机理，以及提供有效的生态学防治措施。本试验将研究温度、pH值和亚硝酸盐浓度这3种常见环境胁迫因子的变化对蜡样芽孢杆菌5种毒力基因表达的影响，同时运用正交试验研究其对斑马鱼致病性的影响，以期能明确养殖条件变化对蜡样芽孢杆菌致病性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用Bc分离自有典型临床出血症状的半滑舌鳎，经检验含溶血素 BL基因(hblC)、肠毒素 T 基因(bceT)、细胞毒素 K 基因(CytK)、多效调控因子(plcR)、非溶血性肠毒素(nheA)，由天津农学院水产动物病害实验室保种。斑马鱼购自天津市中环花鸟鱼虫市场，长度为3.0～3.5 cm，均健康无病，经过1周暂养，待试验鱼稳定后，用于试验。

1.2 培养基

1.2.1 单因素培养基 (1)温度组(T)。将2216E海水液体培养基调pH值为7.2，不加亚硝酸盐。(2)pH值组(P)。将2216E海水液体培养基pH值分别调为6.0、7.2 、8.5，不加亚硝酸盐。(3)亚硝酸盐浓度组(Y)。在pH值为7.2的2216E海水液体培养基中加入亚硝酸盐使其浓度为0.75、1.50、3.00 mg/L。

1.2.2 正交试验设计 采用正交试验设计方法设计3因素(温度、pH值、亚硝酸盐浓度)3水平，因素与水平见表1。在基础2216E海水液体培养基中按照表2方案进行配制。

表1 环境胁迫因子正交试验因素水平

表2 环境胁迫因子正交试验方案

1.3 试验方法

1.3.1 细菌培养 在3组(每组3个重复)单因素培养基中，分别加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。T组分别在25、30、35 ℃摇床180 r/min培养12 h；P组和Y组在30 ℃摇床180 r/min培养12 h。

在配制好的9组正交试验培养基中，分别加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。按照表2的设计，分别在对应温度的摇床180 r/min培养12 h。

1.3.2 RNA的制备和反转录 将经过“1.3.1”节方法培养的细菌菌液1.0 mL，放入1.5 mL无核酸酶的离心管中离心留沉淀及100 μL上清，充分振荡悬浮细菌，直至没有细胞团块。然后按照飞捷(RNAfast200)RNA提取说明书步骤进行RNA提取。对提取的RNA样品均进行凝胶电泳成像检测，检验提取的RNA中无基因组DNA污染。

将提取的RNA测浓度之后，按照TIANScript RT Kit试剂盒说明书进行反转录。PCR扩增所用引物参照表3。PCR反应体系(20 μL)包括：2×TaqPCR Mix(天根)10 μL，25 μmol的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用灭菌超纯水调整终体积至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃ 8 min。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

表3 Bc毒力基因引物序列及扩增产物长度

1.3.3 Bc 致病性试验 根据表2的正交试验方案，进行正交试验。调试好试验水体各项指标后，在2216E海水液体培养基培养，调试最终浓度为108CFU/mL的Bc对鱼体进行养殖功毒试验。根据7 d内试验鱼体死亡情况，记录其死亡率(%)。

2 结果与分析

2.1 单因素对Bc毒力基因表达的影响

2.1.1 温度对Bc毒力基因表达的影响 从表4和图1至图5可以看出，在温度梯度下，CytK和plcR差异不显著，其中CytK和plcR35 ℃时基因表达较强；becT在温度为25 ℃时基因表达显著高于30、35 ℃，30、35 ℃间差异不明显；nheA在温度为30、35 ℃时基因表达显著高于25 ℃，但30 ℃的基因表达与35 ℃时差异不显著；hblC在温度为25、35 ℃时基因表达显著高于30 ℃，而25、35 ℃基因表达间差异不显著。

2.1.2 pH值对Bc毒力基因表达的影响 从表5和图1至图5可以看出，在pH值梯度下，CytK和nheA基因表达均差异不显著，其中CytK在pH值为8.5时基因表达较强，nheA

表4 不同温度值对Bc毒力基因表达的影响

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。表5、表6同。

在pH值为7.2时基因表达较强；becT、hblC和plcR均在pH值为8.5时基因表达显著高于pH值为7.2和6.0，而pH值为7.2、6.0间基因表达差异不显著。

2.1.3 亚硝酸盐浓度对Bc毒力基因表达的影响 从表6和图1至图5可以看出，CytK在亚硝酸盐浓度为3.00 mg/L时的基因表达显著高于0.75、1.50 mg/L，而浓度为0.75、1.50 mg/L 间差异不显著；hblC、nheA均在浓度为1.50、3.00 mg/L 时基因表达显著高于0.75 mg/L时，并且均在 3.00 mg/L 时基因表达略高于1.50 mg/L时；becT和plcR均在浓度3.00 mg/L时基因表达显著高于浓度为1.50、0.75 mg/L 时。

2.2 正交试验对Bc毒力基因表达的影响

影响CytK基因表达的因素依次为亚硝酸盐浓度>温度>pH值，三者之间均无显著差异(表8)，基因表达最高组是第4组，即温度25 ℃、pH值8.5、亚硝酸盐浓度1.50 mg/L(表7)；影响becT基因表达的因素依次为温度>亚硝酸盐浓度>pH值，三者之间差异不显著(表9)，基因表达最高组是第1组，即温度35 ℃、pH值8.5、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L(表7)；影响hblC基因表达的因素依次为温度>pH值>亚硝酸盐浓度，三者间差异不显著，基因表达最高组是第9组，即温度25 ℃、pH值6.0、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L(表7)；影响plcR基因表达的因素依次为温度>亚硝酸盐浓度>pH值，三者间差异不显著(表11)，基因表达最高组是第9组，即温度25 ℃、pH值6.0、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L(表7)；影响nheA基因表达的因素依次为温度>亚硝酸盐浓度>pH值，三者间差异不显著(表12)，基因表达最高组是第9组，即温度25 ℃、pH值6.0、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L(表7)。第1组至第9组Bc毒力基因表达结果见图6至图14。

2.3 环境胁迫因子对Bc致病性的影响

影响Bc致死率的因素为温度>亚硝酸盐浓度>pH值，三者之间无显著差异，其致死率最高组为第9组，即温度 25 ℃、pH值6.0、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L(表13、表14)。

3 讨论与结论

3.1 单因素对Bc毒力基因表达的影响

表5 不同pH值对Bc毒力基因表达的影响

表6 不同亚硝酸盐值对Bc毒力基因表达的影响

表7 Bc毒力基因表达正交试验结果

表8 CytK正交试验结果方差分析

表9 becT正交试验结果方差分析

表10 hblC正交试验结果方差分析

表11 plcR正交试验结果方差分析

表12 nheA正交试验结果方差分析

为明确环境对Bc毒力基因表达的影响，本试验选择了温度、pH值和亚硝酸盐浓度3种环境胁迫因子进行研究。研究结果显示，Bc毒力基因的表达总体上是受温度、pH值和亚硝酸盐浓度影响。试验结果表明，在温度、pH值和亚硝酸盐浓度3种环境胁迫因子影响下，CytK与PlcR均在3种因子得最高值时表达高效，原因在于CytK基因的表达是由CytK启动子序列上的plcR调节因子所控制，同时在CytK的氨基酸末端序列含有1个分泌信号的多肽，这种多肽能调控CytK毒素的分泌[15]。同时hblC也在3种因子的最高值时表达高效，与近年来在广东顺德、中山、惠州出现的中华鳖暴发病症状(腹甲有出血斑，颈部充血肿大，竖起身体浮于水面，以7月左右为发病的高峰期)[4]相一致。发病池塘夏季水温较高，水中可能出现缺氧，造成中华鳖身体浮于水面。becT作为肠毒素基因在温度25℃时表达高效，与黄颡鱼患病时胃、肠道发白，肠内无食，并且该病在每年的9—10月流行现象[7]相一致，而becT在pH值和亚硝酸盐最高值时表达高效，水体中鱼类死亡造成pH值和亚硝酸盐含量增高，进而加速becT基因表达。温度和亚硝酸盐浓度对nheA的影响要大于pH值，非溶血性肠毒素(nhe)的蛋白质成分与hbl区别很大，不具有明显的溶血性[15]，但和hblC一致是在温度和亚硝酸盐最高值时表达高效，共同作用毒力基因表达。

表13 环境胁迫因子对Bc致病性正交试验结果

表14 环境胁迫因子对Bc致病性正交试验结果方差分析

3.2 正交试验对Bc毒力基因表达的影响

环境中同时存在或先后降临的胁迫因素往往不是一种，而是多种。不同的胁迫因素之间有相互作用[16]。因此正交试验能反映环境胁迫因子共同作用下对Bc毒力基因表达的影响。运用正交试验研究环境胁迫因子不同比例条件下的Bc毒力基因表达，从而找到其表达高效时环境胁迫因子的配比。根据试验结果，CytK基因表达量最高为第4组，即温度25 ℃、pH值8.5、亚硝酸盐浓度1.5 mg/L；而becT基因表达量最高为第1组，即温度35 ℃、pH值8.5、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L；hblC、plcR、nheA基因表达量最高均为第9组，即温度25 ℃、pH值6.0、亚硝酸盐0.75 mg/L。在温度较低时，弱碱和强碱均能使毒力基因表达高效，因此在温度较低时，要控制水中的pH值来降低基因表达；当温度较高时，强碱更能使毒力基因表达高效。而水中亚硝酸盐的含量在0.75、1.5 mg/L 水平时更能使毒力基因表达高效。

3.3 环境胁迫因子对Bc致病性的影响

环境胁迫因子对鱼体的各种刺激对鱼类具有致死性[17]，毋庸置疑其会严重影响水产经济；即使是亚致死性的胁迫，也足以引起鱼类的应激反应。虽说应激反应是机体的一种保护性反应，但由于血液皮质激素水平升高，使机体在对应激原的反应时有可能抑制机体特异性和非特异性的防御能力，并导致对病原的敏感性增高[18]。正交试验结果表明，影响Bc致死率的因素影响由大到小依次为温度>亚硝酸盐>pH值，其中温度对致病性影响最强烈。低温会严重影响热带和亚热带生活的水生动物[19]。这印证了在第9组(温度25℃、pH值6.0、亚硝酸盐浓度0.75 mg/L)时，斑马鱼的致死率最高。斑马鱼在pH值为6.0时死亡率高，因为低pH值对鱼的感官和呼吸器官有毒害作用，使其摄食能力下降、耗氧量升高、生存能力减弱。此外，过低pH值会导致渗透压调节机制失调，打破血液酸碱平衡，从而阻碍鱼体生理生化机制的正常运作[20]。亚硝酸盐的毒性作用是由于亚硝酸盐进入血液后，将血红蛋白分子的Fe2+氧化成为Fe3+，抑制血液的载氧能力，从而造成组织缺氧、神经麻痹甚至窒息死亡[21-22]，加速鱼类死亡。本试验虽然显示环境胁迫因子对斑马鱼的致死率没有显著影响，但是在正交试验条件下环境胁迫因子对Bc毒力基因表达起支持作用，为预测实际养殖池塘中发病率的大小和其发病的危险程度提供相关参考，以便于早做调节，减少损失。