SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量

李心雨， 朱 丽， 李新霞,3

(1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011； 2新疆师范大学化学化工学院，乌鲁木齐 830054； 3新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 830011)

大蒜(AlliumsativumL.)为百合科葱属植物蒜的地下鳞茎，作为药食两用植物，已有数千年的历史[1-3]，大蒜具有抗菌、保肝、降血脂、降血压、抗氧化及抗肿瘤等多种药理活性作用[4-5]。前期研究表明大蒜中含有多种化学成分,主要包括含硫有机化合物和皂苷类。蒜酶(Alliinase)，又称蒜氨酸裂合酶，具有催化裂解蒜氨酸、促进大蒜活性物质生成[6-7]等作用，是C-S键化合物的“裂合酶”，是两个相同亚基构成的二聚体糖蛋白，黄色结晶，无臭[8-9]。大蒜蒜酶的中试生产过程中除蒜酶活力外纯度也是蒜酶质量考察的重要指标。其中SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法在蛋白质研究中是一种经典方法，因其稳定性、精密度、重现性较好而被应用[10-15]。本研究采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法测定蒜酶的相对含量及其分子质量，测定不同批次蒜酶供试品，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，PROTEAN®Ⅱ型电泳槽(美国Bio-Rad公司)，GS-800TMCalibrated Densitometer校准型密度计(美国Bio-Rad公司)，Sorvall Legend Micro 21R型微量离心机(美国赛默飞世尔科技公司)，ZHWY-2102C恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，T6型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，AB135-S型分析天平(Mettler Toledo集团)。

1.2试药30%Acr-Bis(博士德生物工程有限公司，批号11122C61)，考马斯亮蓝R-250(美国Sigma-Aldrich公司，批号B-0149)，彩色预染标准蛋白Marker(美国赛默飞世尔科技公司，相对分子质量范围10～170 KDa，批号00442922)，四甲基乙二胺(索莱宝生物科技有限公司，批号810C021)，甘氨酸(美国Sigma-Aldrich公司，批号WXBC4482V，纯度98%)，十二烷基硫酸钠(SDS，上海试四赫维化工有限公司，批号0801101)，三羟甲基氨基甲烷(美国Sigma-Aldrich公司，批号WXBC3998W)，过硫酸铵(北京博奥拓达科技有限公司，批号20160831)，甘油(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号20150712)，溴酚蓝(博士德生物工程有限公司，批号20170322)，5-磷酸吡哆醛(索莱宝生物科技有限公司，批号719B032)，β-巯基乙醇(天津市福晨化学试剂厂，批号20150720)，HyClone磷酸盐缓冲液(江苏泽源生物科技有限公司，批号AB10188719)。

1.3药材蒜酶供试品(新疆埃乐欣药业有限公司，批号201702011、201702012、201702013、201702021、201702022、201702023、201703011、201703012、201703013、201703021、201703022、201703023)；大蒜提取物(新疆埃乐欣药业有限公司提供，产自新疆哈密巴里坤县)。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 电极缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷3.0 g、甘氨酸14.4 g、十二烷基硫酸钠1.0 g，加水适量溶解，用盐酸调pH至8.3，加水稀释至1 000 mL。

2.1.2 载样缓冲液 分别量取1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH= 6.8)1.25 mL，甘油2.5 mL，SDS 0.5 g，25 mg溴酚蓝，加水至5 mL，室温保存，使用前加入250 μL β-巯基乙醇。

2.1.3 磷酸盐缓冲溶液 量取磷酸盐缓冲液100 mL，使用前加入1 mmol/L 5-磷酸吡哆醛溶液2.5 mL。

2.1.4 考马斯亮蓝R-250染色液 称取考马斯亮蓝R-250 0.2 g，分别量取甲醇40 mL、冰醋酸10 mL、水50 mL，混匀备用。

2.1.5 考马斯亮蓝R-250脱色液 量取甲醇40 mL、冰醋酸10 mL，加水定容至100 mL，混匀备用。

2.1.6 供试品溶液的配制 称取蒜酶和大蒜供试品(大蒜在新疆埃乐欣药业有限公司采用冻干工艺制成大蒜提取物)适量，水或磷酸盐缓冲液溶解，涡旋混匀。取300 μL上清液加入100 μL载样缓冲液混匀，100℃水浴加热5 min，12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清液，备用。

2.2SDS-PAGE电泳测定方法配制12%分离胶，灌入玻璃板内至玻璃板的2/3处，加乙醇或水封顶，聚合后，另配制5%浓缩胶溶液，缓慢插入样品梳，静置。采用垂直板电泳，在点样孔中分别加入供试品溶液10 μL、彩色预染标准蛋白溶液5 μL。设置初始电压为80 V，进入分离胶时调至100 V，当溴酚蓝迁移至胶底处，停止电泳。电泳完毕取出胶片，振荡染色50 min，然后用脱色液脱色5 h至凝胶背景透明。取出胶片，于GS-800TM Calibrated Densitometer校准型密度计观察并拍照，采用Gel-Pro analyzer对凝胶结果图进行分析。

2.3蒜酶供试品凝胶电泳影响因素考察

2.3.1 供试品溶剂考察 称取蒜酶供试品约68 mg，至10 mL容量瓶中，分别采用水和磷酸盐缓冲液溶解定容。按“2.1.6”项下配制蒜酶供试品溶液，按“2.2”项下方法进行电泳和染色脱色。试验分别采用纯水(A)和磷酸盐缓冲液(B)溶解供试品，进行凝胶图谱扫描，A、B系列供试品均在小于55 KDa有一条明显的蛋白条带，根据文献[16]蒜酶单个亚基相对分子质量为51.5 KDa，由此可知图中小于55 KDa处的蛋白条带为蒜酶条带，见图1。称取蒜酶供试品40.8、68.0、102.0、136.0、170.0 mg至10 mL容量瓶中，分别用水、磷酸盐缓冲液溶解定容。按“2.1.6”项下配制蒜酶供试品溶液，按“2.2”项下进行电泳和染色脱色。对比彩色预染标准蛋白，A、B系列在55 KDa附近处的蒜酶条带随着蒜酶浓度增加，颜色加深，条带加宽。对比水与磷酸盐缓冲液溶解供试品的凝胶图谱显示，磷酸盐缓冲液溶解的蒜酶供试品条带更清晰集中，试验确定以磷酸盐缓冲液溶解蒜酶供试品更优，见图2。

图1 蒜酶供试品不同溶剂的凝胶电泳图谱

注: A：纯水溶解供试品；B：磷酸盐缓冲溶液溶解供试品；M：为彩色预染标准蛋白

图2 蒜酶供试品不同溶剂的系列浓度凝胶电泳图谱

注：A1-A5分别是蒜酶浓度为4.08、6.80、10.20、13.60、17.00 mg/mL的以水为溶剂的蒜酶供试液；B1-B5分别是蒜酶浓度为4.08、6.80、10.20、13.60、17.00 mg/mL的以磷酸盐缓冲液为溶剂的蒜酶供试液；M为彩色预染标准蛋白。

2.3.2 蒜酶供试品浓度考察 称取蒜酶供试品136、170、204、238、272、306、340 mg至10 mL容量瓶中，磷酸盐缓冲液溶解定容。按“2.1.6”项下配制蒜酶供试品溶液，按“2.2”项下方法进行电泳和染色脱色。蒜酶供试品浓度在30.6～34.0 mg/mL蒜酶供试品蛋白浓度较高，不便于准确测定蛋白分子量，而浓度为23.8 mg/mL蒜酶供试品在15 KDa附近蛋白条带不明显，所以确定蒜酶供试品浓度为27.2 mg/mL进行蒜酶供试品的电泳测定，见图3。

图3 以磷酸盐缓冲液为溶剂的不同浓度蒜酶供试品凝胶图谱

注：B4-B10分别是蒜酶浓度分别为13.6、17.0、20.4、23.8、27.2、30.6、34.0 mg/mL的以磷酸盐缓冲液为溶剂的蒜酶供试液，M为彩色预染标准蛋白。

2.4蒜酶相对含量和相对分子质量测定

2.4.1 标准曲线的制备 已知在SDS-PAGE电泳中蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈线性关系，符合下式：lgMW=K-bRf，MW为蛋白质的相对分子质量，Rf为相对迁移率，b为标准曲线的斜率，K为常数[17-18]。本试验以彩色预染蛋白Marker的比移值为横坐标(X)，相对分子质量的对数(lgMW)为纵坐标(Y)建立标准曲线，得标准曲线方程：Y=-1.268 6X+2.106 8，r=0.972 3。将不同蛋白条带的比移值代入标准曲线方程，可得到各条带的相对分子质量，记录数据。

2.4.2 蒜酶供试品测定 称取蒜酶供试品约272 mg，至10 mL容量瓶，磷酸盐缓冲液溶解定容。按“2.1.6”项下方法配制蒜酶供试品溶液，按“2.2”项下方法进行电泳和染色脱色。对12批蒜酶供试品进行测定，不同的蒜酶供试品在55 KDa和10 KDa处均有较为明显的2条蛋白条带，见图4。相对分子质量在40～55 KDa蛋白条带和10 KDa蛋白条带颜色较深且宽。蒜酶供试品在45～55 KDa均显示清晰条带，12个蒜酶供试品中蒜酶平均相对分子质量为50.84 KDa，在总蛋白条带中蒜酶平均相对含量达52.39%，除蒜酶条带外，10 KDa处也有明显的蛋白条带，平均相对分子质量为10.56 KDa，蛋白平均相对含量为52.02%，见表1。

2.4.3 不同样品中蒜酶相对含量和相对分子质量的测定 分别称取大蒜供试品和蒜酶供试品约272 mg，加磷酸盐缓冲液定容至10 mL容量瓶中。按“2.1.6”项下方法配制蒜酶供试品溶液，按“2.2”项下方法测定，蒜酶供试品中的蒜酶相对含量大于大蒜中的蒜酶相对含量，在1～9蒜酶供试品中，蒜酶平均相对分子质量为51.12 KDa，平均相对含量50.20%；大蒜中蒜酶平均相对分子质量为50.52 KDa，平均相对含量6.28%。经提取纯化后的蒜酶供试品在平均相对分子质量10.42 KDa有较为明显的蛋白条带，蛋白平均相对含量28.39%；大蒜在平均相对分子质量11.58 KDa处有明显蛋白条带，蛋白平均相对含量93.71%，见图5、6、表2。

图4 蒜酶供试品凝胶电泳图谱

注：1～12分别是不同批次蒜酶供试品，依次为201702011、201702012、201702013、201702021、201702022、201702023、201703011、201703012、201703013、201703021、201703022、201703023；M是彩色预染蛋白。

表1 不同批次蒜酶的主要共有蛋白条带

图5 大蒜与蒜酶蛋白含量凝胶电泳图谱比较

注：1～9是蒜酶供试品；10～14是大蒜供试品，M是彩色预染蛋白。

图6 蒜酶和大蒜供试品主要共有蛋白条带含量柱状图

注：1～9为蒜酶供试品；10～15为大蒜供试品。

表2 蒜酶和大蒜供试品的主要蛋白条带

3 讨论

本研究建立SDS-PAGE法测定蒜酶含量和分子量，分别对供试品溶样方式及样品浓度进行考察，确定最佳条件，该条件下蒜酶条带清晰，无拖尾现象，经蒜酶供试品和大蒜提取物两种样品的考察，显示此方法可检测不同样品中的蒜酶，方法简便、可行。通过SDS-PAGE法测定蒜酶含量，旨在为大蒜蒜酶提取纯化奠定实验研究基础。