在实验室完成细粒棘球绦虫生活史小鼠模型的建立

王 甜， 郑雪婷， 齐文静， 何 黎， 张文宝， 李琳琳， 李 军

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院临床医学研究院， 乌鲁木齐 830054)

包虫病是呈全球性分布的一种人兽共患病，有两种分型,分别是由细粒棘球绦虫(E.granulosus, E.g)感染所致的囊型包虫病(Cystis Echinococcosis, CE)和多房棘球绦虫(E.multilocularis, E.m)感染所致的泡型包虫病(Alveolar echinococcosis, AE)。细粒棘球绦虫寄生于人、家畜和啮齿动物的肝、肺等实质器官内[1]，对人身体健康和畜牧经济造成严重影响[2]。实验室研究用原头蚴通常采集于自然感染绵羊或包虫病患者病灶内[3]，但受季节、畜牧屠宰量等各种因素限制。首先包虫病呈现地理分布，主要分布在我国新疆和内蒙古高原、青藏高原、陕甘中黄土高原等[4-5]，因此其它地区研究材料匮乏。其次，采集于不同地点、时间、季节等自然感染的羊肝，收集的原头蚴总量及活力完全不同，因此在实验室内获得原头蚴，体外培养成微囊注射到小鼠体内获得原头蚴，完成实验室内原头蚴→原头蚴的循环至关重要。本研究采用高感染率的腹腔注射微囊法感染BALB/c小鼠[6]，通过解剖不同感染时期小鼠，确定生长发育出细粒棘球绦虫原头蚴的可育囊时间，为今后包虫病的生物学及医学研究提供保障。

1 材料方法

1.1实验动物雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，SPF级，购自新疆医科大学实验动物中心，饲养于新疆医科大学第一附属医院实验动物中心。

1.2主要仪器与试剂离心机(Centrifuge 5424R型)购于德国eppendorf公司，酶标仪(MULTISKAN SPECTRUM型)和CO2细胞恒温培养箱(series 8000 DH型)购于Thermo公司，生物安全柜(HFsafe-1200B2型)购于中国Heal Force公司，D-Hank′s缓冲液(SH30031.02)、胎牛血清(SV30087.02)、磷酸缓冲盐溶液、青/链霉素溶液(SV30010)、RPMI-1640培养基(SH30809.01)购于美国Hyclone公司，多聚甲醛(P6145)、胃蛋白酶(P7000)、亚甲基蓝购于德国Sigma-Aldric公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(23227)购于美国Thermo公司，羊抗鼠IgG购于美国BETHYL公司。

1.3细粒棘球绦虫原头蚴的制备及体外微囊的培养取自然感染的绵羊肝脏或肺脏，采集细粒棘球绦虫原头蚴。用1%胃蛋白酶(pH 2.0)37℃消化30 min，用含有双抗的PBS在无菌条件下漂洗3～5遍后，亚甲基蓝检测活力>95%，用含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，体外培养约2个月，即可获得直径约200～300 μm的细粒细粒棘球绦虫微囊[6]。

1.4细粒棘球绦虫微囊感染BALB/c小鼠将BALB/c小鼠80只，根据体质量随机分为正常饲养组(3、6、9、12个月)、细粒棘球绦虫感染组(3、6、9、12个月)，感染组用无菌PBS(含1%双抗)漂洗培养得到的细粒棘球绦虫微囊3～5遍，以每只鼠35个微囊的量，采用腹腔注射的途径接种于BALB/c小鼠体内，建立细粒棘球绦虫感染小鼠模型[6]。

1.5细粒棘球绦虫感染小鼠处理

1.5.1 剖杀感染小鼠 分别在感染后第3、6、9、12个月称重，采血，剖杀小鼠，观察小鼠腹腔内包囊生长情况，细查包囊寄生部位和包囊数量及外观形态。取出包囊用PBS漂洗，用滤纸吸干囊外壁水分，刺破包囊，收集囊液，光学显微镜下观察囊液沉淀物中是否有原头蚴，并在光学显微镜下拍照、记录原头蚴状态。

1.5.2 小鼠感染模型组织学鉴定 取完整包囊，PBS漂洗3～5次，用4%的多聚甲醛固定。包囊经过伊红预染色3 h、梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、苏木素—伊红(HE)染色，光学显微镜下观察包囊结构，拍照测量包囊角质层厚度。

1.5.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清抗体变化 收集羊源细粒棘球绦虫囊液，离心，浓缩上清。用BCA试剂盒测定羊囊液蛋白含量为1.2 mg/mL，以5 μg/mL孔的浓度包被到96 孔酶标板上，小鼠血清浓度1∶100，酶标物为羊抗鼠IgG，工作浓度为1∶5 000。底物显色剂为ABTS，以样品孔与阴性孔血清的光密度(OD 405 nm)比值大于3(P/N≥3)为阳性，反之为阴性[7]。

2 结果

2.1BALB/c小鼠继发感染模型不同时间段解剖观察在观察感染细粒棘球绦虫微囊不同时间段小鼠发现，感染早期小鼠体质量、形态无明显变化，但随感染时间的增长小鼠腹部隆起愈加明显，感染3个月、6个月、9个月小鼠体质量与同批正常组小鼠体质量比较差异均无统计学意义，但感染12个月小鼠体质量增长至(32.76±3.76) g，饲养12个月小鼠体质量为(27.20±1.21) g，与正常组小鼠体质量比较明显增加，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

解剖发现感染细粒棘球绦虫微囊3个月的10只小鼠腹腔内包囊数量不等，包囊多游离于腹腔，但有少量包囊镶嵌于肝脏表面，10只小鼠共计196个包囊，包囊直径为(3.25±1.44) mm。感染6、9个月小鼠腹腔内包囊囊壁增厚增白，包囊直径增大至(7.20±2.53) mm、(9.00±2.66) mm，但包囊总数减少至86个。感染细粒棘球绦虫12个月的10只小鼠体内的24个包囊直径增大至(14.21±3.14) mm，见表1。

刺破包囊囊壁，并充分漂洗囊壁，在光学显微镜在观察发现，感染细粒棘球绦虫微囊3～9个月小鼠体内包囊均未见原头蚴，而感染细粒棘球绦虫微囊12个月的小鼠体内包囊有原头蚴，原头蚴活力良好(图2)，且10只小鼠体内的24个包囊均可见原头蚴，共计43 000个原头蚴。

注：与饲养12个月组比较, *P<0.05。

感染时间/月小鼠数量/只包囊直径/mm共计包囊数/含原头蚴包囊数/个原头蚴量/个3103.25±1.44196/006107.20±2.53130/009109.00±2.6686/00121014.21±3.1424/2443 000

a：体外培养细粒棘球绦虫微囊

b：小鼠细粒棘球绦虫感染3个月模型体内包囊

c：小鼠细粒棘球绦虫感染12个月模型体内包囊

d：小鼠12个月包囊沉淀物

图2小鼠细粒棘球绦虫继发感染3个月、12个月小鼠体内包囊和囊液沉淀物

分离感染不同时期小鼠体内包囊，经过4%多聚甲醛固定、伊红预染色、酒精脱水、石蜡包埋和HE染色，结果显示，感染不同时期包囊生发层和角质层染色均匀，但感染早期生发层着色较深，说明生发层生长较为活跃[8]。感染晚期生发层逐渐成熟，着色较浅。测量角质层厚度发现感染6个月、9个月的包囊囊壁的角质层厚度较感染3个月也表现出增厚，但差异无统计学意义。但感染12个月包囊角质层厚度约为(713.41±91.08) μm，较感染3个月包囊囊壁角质层厚度[(206.89±43.93) μm]明显增厚，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3，提示包囊囊壁角质层的厚度与产生原头蚴有关。

2.2小鼠血清抗体的变化饲养3个月正常组小鼠血清OD值为(0.30±0.09)，感染细粒棘球绦虫微囊3个月小鼠血清OD值为(1.19±0.13) (P/N≥3，为阳性)，与正常组比较抗体水平明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)。同时感染12个月小鼠血清OD值为(1.51±0.41)，与同批正常小鼠血清OD值比较也明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

a：感染3个月小鼠包囊病灶LL角质层(laminated layer); b：感染12个月小鼠包囊病灶GL生发层(germinal layer)

图3小鼠细粒棘球绦虫继发感染模型包囊病灶的组织学观察(100×)

羊囊液抗原检测细粒棘球绦虫微囊感染小鼠血清，血清中囊液抗原的抗体水平随时间变化呈递增的趋势，表现出较强特异性，但感染3个月、6个月、9个月、12个月小鼠血清OD值差异无统计学意义，说明感染小鼠产生的抗体水平与产生原头蚴无直接关系。

3 讨论

Hui等[9]研究发现体外培养包囊时间约为12个月，可见原头蚴，但是原头蚴数量较少，且需要耗费大量的人力物力[10]等，所以我们用体内方法生产原头蚴。本研究表明小鼠感染3个月到感染12个月体内包囊直径从(3.25±1.44) mm增大至(14.21±3.14) mm，包囊生长呈时间依赖性增长，但是比较感染3个月小鼠体内直径同样为10 mm包囊和感染12个月直径为10 mm包囊，刺破后发现感染3个月包囊囊液中无原头蚴，而感染12个月小鼠体内包囊可发育出原头蚴，表明包囊是否发育出原头蚴与包囊直径大小无直接关系。同时发现小鼠体内包囊总数随着感染时间延长，包囊总数由感染3个月的196个减少到感染12个月的24个，说明包囊在小鼠体内生长发育呈明显竞争性，不可育包囊可能被机体侵蚀或自然死亡，可育包囊随时间延长而发育原头蚴。

注：与饲养3个月组比较,*P<0.05; 与饲养12个月组比较,△P<0.05。

图4囊液抗原ELISA检测细粒棘球绦虫小鼠模型血清抗体

ELISA实验发现感染3个月小鼠血清OD值为(1.19±0.13)，感染12个月小鼠血清OD值为(1.51±0.41)，呈阳性反应。感染12个月小鼠血清OD值与感染3个月、6个月、9个月的小鼠血清OD值相比呈递增趋势，但差异无统计学意义。表明ELISA方法检测感染小鼠血清(1∶100稀释)抗体水平，可用来检测细粒棘球绦虫感染是否成功，不能作为小鼠体内包囊的是否发育出原头蚴的指标。

感染细粒棘球绦虫微囊小鼠体内包囊病理结果显示，感染12个月模型小鼠，包囊囊壁明显增厚、增白，包囊囊壁病理学检查发现囊壁角质层增厚至(713.41±91.08) μm，与感染3个月小鼠体内包囊囊壁角质层厚度相比，差异有统计学意义。很多研究也表明多房棘球绦虫感染小鼠后3个月左右可在病灶内发现原头蚴[11]，但在感染1～9个月细粒棘球绦虫小鼠体内包囊未见原头蚴[6]，说明包囊囊壁角质层厚度可能是包囊是否发育为可育囊重要指标。

前期研究发现感染细粒棘球绦虫微囊56 w后，在BALB/c小鼠体内一个直径为31 mm的包囊内发现4个原头蚴[7]。本研究在小鼠感染细粒棘球绦虫微囊12个月(52 w)即可生产出43 000个原头蚴，推测新疆株细粒棘球绦虫原头蚴与澳大利亚株细粒棘球绦虫原头蚴在BALB/c小鼠体内存在明显差别，而新疆株细粒棘球绦虫原头蚴在BALB/c小鼠体内生长发育更快。有研究报道，通过腹腔注射15 000个新疆株原头蚴感染子午砂土鼠，在357 d发现8只小鼠中有7只小鼠体内包囊可发育出原头蚴[12]，而在本研究中通过腹腔注射35个细粒棘球绦虫微囊，感染12个月的10只BALB/c小鼠体内均可见原头蚴。推测可能新疆株细粒棘球绦虫微囊在BALB/c小鼠体内生长更为稳定，并发育良好。

本研究结合细粒棘球绦虫体外培养和小鼠体内感染完成原头蚴→原头蚴的实验室循环，并用感染细粒棘球绦虫小鼠生产出原头蚴，不仅为后期细粒棘球绦虫原头蚴取材提供一个时间借鉴，还可维持稳定实验室研究用原头蚴，最终为后期研究细粒棘球绦虫的克隆奠定基础。