质谱-色谱技术在早产儿蛋白质代谢中的应用研究

马丽霞, 郑晓玲, 朱小敏

(珠海市第二人民医院新生儿科， 广东 珠海 519000)

近年来，随着医学的飞速进展，早产儿的出生率呈逐年上升趋势，且早产儿的存活率也有大大提高，但存活者却存在着各种并发症，其中出生早期的营养不足是影响早产儿后期生存质量的常见问题[1-2]。

近期，已有大量研究显示[3-4]，早产儿出生早期营养摄入不足不仅影响疾病恢复与生长发育，而且还可影响大脑细胞发育，导致永久性脑损伤，因此常常需要肠外营养，目前新生儿科工作者都采用早期、足量的肠外营养为早产儿提供糖类、蛋白质以及脂肪等营养物质，以满足其生后“追赶性生长”的要求[5-6]。但随之而来的也有许多远期并发症，例如心血管系统的疾病、糖尿病和肥胖症等代谢综合征[7]。这就需要有一个精确的评估早产儿三大代谢物质(蛋白质、糖类、脂肪)代谢特点的方法，来指导新生儿科医生在临床工作中“精确”而且“个体化”地为不同的早产儿提供营养支持。

本研究利用气相色谱法-质谱技术(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)，分析早产儿和足月儿尿液中多种蛋白质的代谢产物：赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸，寻找早产儿特异的生物标志物和代谢通路，为早产儿合理补充氨基酸提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象选择2016年7月-2017年12月在珠海市第二人民医院(珠海市中西医结合医院)新生儿科的47例胎龄为28～36 w的早产儿为研究对象，归入试验组(早产儿组)。选择同时期分娩的正常足月儿(胎龄37～41 w)45例为对照组(足月儿组)。2组新生儿出生体质量和胎龄差异具有统计学意义(Z=-3.752，P<0.001；Z=-3.249，P<0.001)。本研究获得医院伦理委员会的批准，研究对象选择获得受试者家属的知情同意。

1.2入选标准(1)胎龄28～36 w出生的早产儿，无明显窒息史(产前和产时)，生后6 h内未出现并发症(新生儿呼吸窘迫综合征、新生儿高胆红素血症、新生儿缺氧缺血性脑病、新生儿感染、新生儿颅内出血、母婴血型不合溶血病等)，Apgar评分≥8分，血气分析pH和乳酸值未见明显异常。(2)足月新生儿(胎龄37～41 w)，无合并症，Apgar评分≥8分，血气分析pH和乳酸值在正常范围内。(3)所有新生儿(早产儿和足月儿)均为适于胎龄儿，生后6 h内未实施头罩吸氧、CPAP和(或)机械通气等，未使用抗氧化剂(如维生素E、氨溴索等)治疗。(4)所有新生儿(早产儿和足月儿)母亲既往无慢性疾病史(如糖尿病、高血压、心血管疾病及肾脏疾病等)，无感染性疾病史(如结核、梅毒等)，无营养不良病史，无不良嗜好(如酗酒、吸烟、吸毒等)及滥用药物史。早产儿母亲可能存在妊娠合并症；足月儿母亲无妊娠合并症存在。

1.3喂养方式所有入选的早产儿和足月儿均于生后3 h开始经口喂养婴儿配方奶粉：早产儿和足月儿分别使用的特别能恩(热卡2 084 kJ/100 g)和超级能恩(热卡2 145 kJ/100 g)均为雀巢(Nestle)公司产品，早产儿按1.0～2.0 mL·kg-1·h-1量开始喂养，每2小时喂哺1次；足月儿按起始量每次20～30 mL，每3小时喂哺1次。所有早产儿和足月儿收集尿液标本前均未进行肠道外营养支持。

1.4方法

1.4.1 尿液标本收集 新生儿出生24 h内留取尿液标本。记录一般临床资料(住院号、胎龄、出生体质量、诊断、标本收集时间)，用尿袋收集清洁尿液2 mL，置于普通干燥管，或浸透于专用尿液收集的滤纸片(日本松本生命科学研究院研制)上，用油性记号笔写上编号和姓名，置于-20℃冰箱里保存，在1 w内进行检测。

1.4.2 尿液代谢产物检测 应用气相色谱-质谱联用仪进行尿液代谢产物分析，测定尿代谢产物水平，包括赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸。

1.4.3 仪器与试剂 气相色谱-质谱联用仪(日本电子，Q1000型)、试管浓缩仪(维新明智科技有限公司，TC-8F)、干式加热器(北京来亨科贸有限责任公司，L-129A)、试管浓缩氮吹仪(北京来亨科贸有限责任公司，023-119A)、循环水真空泵(上海亚荣生化仪器，SHZ-ⅢD)、离心机(德国艾本德公司，5147-C)、色谱柱(日本Ultra Alloy+5UA5-30M-0.25F)、尿激酶(美国Sigma Type CⅢ)、诱导剂(美国Sigma，BSTFA/TMCS)。

2 结果

2.12组新生儿的尿液赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸水平分析早产儿组的尿液中赖氨酸、苯丙氨酸以及组氨酸水平均明显低于足月儿组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1早产儿与足月儿组尿液赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸水平(正常值的倍率)

分组例数赖氨酸苯丙氨酸组氨酸早产儿组470*0*0*足月儿组450.21±0.280.02±0.021.24±1.80t值3.4004.0643.072P值0.0030.0010.006

注：*早产儿组中所有早产儿尿液中赖氨酸、苯丙氨酸以及组氨酸水平均在可测范围之下(数值为0)。

2.22组新生儿尿液中鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸水平分析早产儿组的尿液中鸟氨酸、延胡索酸及苹果酸水平均明显低于足月儿组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3 讨论

气相色谱法-质谱法联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术是代谢组学研究中的一种主要方法，是一种全新的高通量化学分析和多维统计分析方法，仅需对极少量物质(如尿液、血液)进行分析，就可检测到生物体内代谢产物的变化[8]。目前已广泛应用于心血管疾病、传染病、癌症及精神分裂症的辅助诊断和治疗效果的监测。在儿科领域主要用于遗传代谢性疾病的诊断和筛查上[9-10]。国外最新研究表明，此项技术应用于新生儿可为早期诊断、监测新生儿疾病的重要生物标志物(Biomark)提供重要线索[11-12]。

表2 早产儿与足月儿组尿液鸟氨酸水平(正常值的倍率)

尿液中含有三大营养物质以及多种其他物质的代谢产物(中间或终末性的)，这些代谢产物的水溶性相对而言较高，所以它们经过肾脏后仍可大量排出，故尿中测出的浓度要远高于其在血液中的浓度。

本研究应用UP-GC-MS技术选择性测定了部分早产儿及足月儿尿液中的氨基酸，包括在新生儿生长发育过程中发挥重要作用的赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸，以及直接或者间接参与尿素循环的鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸。赖氨酸是一种碱性氨基酸，能促进生长发育、提高免疫水平，并且对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用；同时赖氨酸能与其他物质共同形成胶原蛋白，能够强化骨骼、肌肉、肌腱、关节软骨和结缔组织等组织器官。赖氨酸是合成蛋白质的氨基酸中最重要的一种，其缺乏会影响其余氨基酸的利用，故有人称其为人体必需氨基酸的第一位。苯丙氨酸参与生成肾上腺素、甲状腺素和黑色素。组氨酸对儿童或者成人都为必需氨基酸。组胺能强烈地舒张血管，与许多炎症反应、变态反应关系密切，还能促进胃蛋白酶及胃酸的分泌。鸟氨酸参与尿素循环，与尿素生成密切相关，延胡索酸参与葡萄糖氧化产能的过程，不仅能调节免疫系统，还能清除炎症过程中释放的破坏性“氧自由基”，促进神经细胞存活。苹果酸是生物体三羧酸循环的中间产物，其有护肝作用，也可改善脑组织的能量代谢进而调整脑内的神经递质。

本研究结果显示， 早产儿组的赖氨酸、苯丙氨酸以及组氨酸水平均明显低于足月儿组。可能的原因为： (1)新生儿体内原始氨基酸储备来自于妊娠晚期的胎儿期，胎龄越小，其体内氨基酸储备越少；(2)氨基酸代谢过程需要许多酶参与，这些酶的活性随着胎龄增长而日益成熟，而早产儿体内某些酶尚未成熟，氨基酸代谢受之影响，导致其体内的氨基酸相对缺乏；(3)早产儿生后比足月儿更需要充分的氨基酸供给来完成其“追赶性生长”的过程，其体内的氨基酸利用更多，故而造成其尿中氨基酸的排泄减少；(4)早产儿肾脏功能发育完善程度不及足月儿，故氨基酸经肾脏排出的量相对减少。

鉴于上文所述几种氨基酸的代谢特点，在临床工作中为早产儿补充氨基酸时不仅要注意量的补充，且不同氨基酸的成分配比也应得到重视。早产儿生后营养供给的途径主要是肠道外营养，所以在临床上使用适合早产儿的氨基酸制剂十分重要。关于现有的小儿氨基酸制剂是否确实适合早产儿生长发育、对其远期健康是否有利尚无充分的研究报道，结合本研究结果，有必要对更多早产儿及足月儿进行尿代谢产物筛查分析及其他相关辅助检查，建立大样本、多中心的临床研究，完善各胎龄新生儿氨基酸代谢谱，为新生儿(尤其是早产儿)适当(包括量及种类)地提供氨基酸补给提供依据。