汉族人群乙型肝炎病毒感染者外周血IL-28B基因多态性研究*

谈国蕾，孙梅，王建芳，吴旭平

HBV感染所致的肝硬化（liver cirrhosis，LC）、肝衰竭（liver failure，LF）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）较为常见[1]。白细胞介素 -28B（in terleukin 28B，IL-28B）基因作为一个重要的细胞因子基因，具有影响抗病毒和免疫调节等作用，在HBV感染进程中有着重要的作用[2，3]。本研究检测了HBV感染者外周血IL-28B基因rs8099917和rs12979860多态性，以探讨其与乙型肝炎病程进展的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究对象为2013年1月～2014年12月南京市第二医院门诊及住院的HBV感染者。按照2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]对疾病诊断并分组如下：无症状携带者（asymptotic HBV carriers，ASC）45例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者181例，LC患者69例，HCC患者79例，LF患者79例。另选同期在我院健康体检者145例作为对照。所有人群无重叠或混合其他病毒感染，入选对象均为江苏籍汉族人群。

1.2 外周血IL-28B基因多态性检测 取外周血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的DNA Blood Kit提取DNA，直接用于PCR扩增或者保存于-20℃备用。根据NCBI上IL-28B基因序列设计引物。rs12979860位点上游引物rs860-F：CTTATCGCATACGGCTAGGC，下游引物 rs860-R：GGACCGCTACGTAAGTCACC。rs8099917位点上游引物rs917-F：TTCACCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引 物 rs917-R：TCCTAAATTGACGGGCCATCTGTTTC。引物由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）合成。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃30 s，55℃ 30 s,72℃ 30 s；共 35 个循环，最后，72℃延伸5 min。取PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳确定扩增结果。PCR产物用QIAGEN公司QIA Quick PCR Purification kit进行产物纯化。将纯化后的PCR产物送南京金思瑞生物科技公司测序。分析和记录IL-28B rs8099917和rs12979860位点的基因型和等位基因。

1.3 统计学分析 采用Pearson x2检验对IL-28B rs8099917与rs12979860位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，计量资料以（±s）表示，计数资料采用例数表示。应用SPSS 17.0软件进行方差分析、x2检验和Binary Logistic回归分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组人群的临床特点 453例HBV感染者年龄和性别比较见表1，ASC患者中男性比例显著少于健康人群（x2=10.991，P=0.001），LC 患者中男性比例显著高于健康人群（x2=7.684，P=0.006）。LC患者、HCC患者和LF患者的年龄显著大于健康人群（P＜0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 对健康人群IL-28B基因2个位点分别进行平衡检验，经拟合优度x2检验，各个基因型分布实际值近似于推算获得的期望值，提示这些rs8099917与rs12979860位点处于遗传平衡状态（P＞0.05），表明用于本研究的对照样本具有群体代表性，对照组中多态性位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果见表2。

表1 各组人群年龄和性别（n,±s）比较

表1 各组人群年龄和性别（n,±s）比较

与健康组比，①P<0.05

健康人（n=145） ASC（n=45） CHB（n=181） LC（n=69） HCC（n=79） LF（n=79）性别（男/女） 98/47 18/27① 135/46 59/10① 63/16 54/25年龄(岁) 35.3±14.2 35.7±8.6 36.6±12.5 47.8±11.3① 55.5±10.0① 45.8±12.8①

表2 对照人群多态性位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果

2.3 rs12979860位点基因型和等位基因分布情况 在本地区人群中，IL-28B基因rs12979860位点有三种基因型，即CC、CT和TT，以CC和CT为主要基因型，TT型只在健康人群和CHB患者中存在。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者CC型频率与健康人群无显著性差异（P=0.797，P=0.422，P=0.428，P=0.997），只有LF人群中CC型频率显著高于健康人群（P=0.045），提示CC型与LF的患病风险有关（OR=0.257）。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者C等位基因频率与健康人群无显著性差异（P=0.685，P=0.406，P=0.352，P=0.907），只有 LF 患者显著高于健康人群（P=0.038），提示C等位基因与LF的患病风险有关（OR=0.255，表3）。

表3 IL-28B基因rs12979860基因型和等位基因频率（%）分布

2.4 rs8099917位点的基因型和等位基因分布情况 在本地区人群中，IL-28B基因rs8099917位点有三种基因型，即 TT、TG、GG，以 TT、TG 为主要基因型。GG型只在健康人群和CHB患者中存在。LC患者TT型频率显著高于健康人群（P=0.041），而ASC、CHB患者、HCC患者、LC患者与健康人群无显著性差异（P=0.414，P=0.245，P=0.179，P=0.323），提示TT型与肝硬化的患病风险有关（OR=0.288）。ASC、CHB患者、HCC患者、LF患者与健康人群差异均不具有统计学意义（P=0.540，P=0.245，P=0.166，P=0.264），只有LC患者T等位基因比例显著高于健康人群（P=0.036），提示T等位基因与LC的患病风险有关（OR=0.299，表 4）。

表4 IL-28B基因rs8099917基因型和等位基因频率（%）分布

3 讨论

本研究分析了IL-28B基因2个SNPs位点（即rs8099917和rs12979860）在健康人群与ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者和LF患者中的分布。结果表明，在健康人群和CHB患者或HCC患者中这两个位点分布都无显著性差异，即rs8099917和rs12979860位点多态性与HBV感染引起的CHB或HCC无明显相关。本研究发现的这个结果与国外学者]在健康人群和CHB患者中的结果，rs8099917和rs12979860基因型和等位基因分布无显著性差异是一致的[5-9]。

但是，IL-28B rs12979860和rs8099917多态性与HCC是否相关有着不同的结论。其他相关研究[10-12]表明，IL-28B rs12979860位点T等位基因在HCC患者中更普遍存在，而本研究与Akkiz[13]发现的rs-12979860位点在健康人群和HCC患者无显著性差异的结果是一致的。尚有其他报道[8,14，15]发现该位点在HCC患者和LC患者中都无显著性差异。此外，国内哈明昊[16]报道，IL-28B rs12979860位点T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者中无显著性差异，可能不是病情进展的影响因素，与本文研究结果是不一致的。本研究还发现IL-28B rs12979860位点在健康人群和LF患者中有显著性差异，C等位基因的HBV携带者罹患LF的风险增加。是否与LF相关的报道较少，本研究的下一步将进一步扩大LF患病人群，研究LF发生发展的机理及其与遗传基因的相关性问题。

本研究发现IL-28B基因rs8099917位点在LC患者与健康人群有显著性差异，即IL-28B rs8099917位点T等位基因的携带者罹患LC的风险增加。Kimkong et al报道[11]在台湾地区，相对于健康人群组，IL-28B T等位基因都是乙型肝炎病程进展的易感基因，T等位基因是CHB的易感基因，但不是LC和HCC的易感基因。Kim et al[17]报道，相对于正常人，携带T等位基因者罹患HCC的风险增加。哈明昊[16]报道，T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者无显著性差异。也有与之不一致的报道，比如Hodo et al[18]发现T等位基因是肝癌的高风险基因，而Lee et al[14]报道该点在HCC患者和LC患者中都无显著性差异。国内王艳[19]报道IL-28B G是发生HCC的高风险基因，T则是保护性基因。这些在不同地区和不同人群研究结果的差异，提示IL-28B基因多态性导致乙型肝炎病情进展仍存在较多的争议。

综上所述，通过本研究发现了人外周血IL-28B rs8099917和rs12979860基因多态性与HBV感染后的病情进程有一定的关联，且可能受到不同地区不同种族人群遗传结构的影响，以及研究对象样本量的影响，其具体机制仍有待进一步研究。