益母草碱对窒息新生大鼠心肌损伤的保护作用及机制研究＊

张丽娜，吴星恒，王平，梁莹

(1、南昌大学第一附属医院儿科，南昌 330006；2、南昌市第五医院，南昌 330001；3、江西省儿童医院，南昌 330006)

APJ本质上属于蛋白的一种，与血管紧张素Ⅱ型受体之间有密切的关系并且APJ也能够与G蛋白联合发生作用，APJ有一种配体，即Apelin，其来源上属于内源性。Apelin/APJ系统在体内分布广泛，在多组织器官尤其是心血管系统和脂肪组织中高度表达。Apelin具有增加心肌收缩力、降压、舒张血管、抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大、阻止活性氧簇(ROS)依赖的心肌细胞肥大等重要的心血管保护作用[1]。但其在心血管疾病中的表达研究得出的结论不一。

益母草碱是从益母草中提炼的具有生物学作用的一种物质，益母草之所以可以保护心肌，就是因为益母草碱的存在，具有抗血小板聚集、降低血液粘稠度、舒张血管、增加血流量等作用。近年来，益母草碱对缺氧缺血损伤心肌的保护作用已引起研究者们的广泛关注。

本课题组应用新生鼠建模，并通过对新生鼠的相关指标进行监测，确定心肌受损的程度，并同时对Apelin/APJ蛋白的表达进行分析与评估，探讨窒息新生鼠心肌缺氧缺血损伤病理生理机制是否与内源性Apelin/APJ有关；药物益母草碱干预后能否起到心肌保护作用并探讨其机制。

1　材料与方法

1.1研究对象的分组 选取实验动物 （新生鼠）共计72只，并按体重的大小进行编号处理，采取随机的方式进行分组：共分成3个大组，即正常组、窒息组、益母草碱组，每组24只，再按照处理时间点的不同将每个大组分成3个亚组，正常组分为30min亚组，60min亚组，120min亚组，每组8只实验动物；窒息组也分为30min亚组，60min亚组，120min亚组，每组8只实验动物；同样益母草组也分成3个亚组，即30min亚组，60min亚组，120min亚组，每组8只实验动物。

1.2建模的方法 取容量为55ml的密封的完整的磨口瓶，内置钠石灰，质量大约5g，将窒息组的实验动物置于其中，静待片刻，等实验动物安静下来以后再开始实验。在磨口瓶的瓶口涂上凡士林，并将磨口瓶密封，让实验动物处在缺氧的条件下并立即开始计时，时间持续0.5h，缺氧处理时间结束的时候进行复氧的操作，时间持续2h[2]。正常组的实验动物采取相同的操作，但实验过程中不将磨口瓶封闭，不缺氧；益母草碱药物组窒息后立即予腹腔注射益母草碱5mg/kg[3]（药物由天津马克生物技术有限公司提供，A0539）。窒息组的实验动物在进行缺氧处理以后立即腹腔注射5mg/kg生理盐水。各组新生鼠分别于模型建立后30min、60min、120min分批取心脏血及心脏标本行各项指标的检测（每个时间点8只）。

1.3相关指标的测定 将建模成功的实验动物于30min、60min、120min 3个时间点应用戊巴比妥麻醉，并进行开胸处理，于心脏取血，0.3ml即可，用离心机分离，取0.1ml血浆，进行肌酸激酶和乳酸脱氢酶的测定，应用的设备应为通过检测的全自动生化分析仪(Olympus)。

1.4组织的病理学检查 将建模成功的实验动物于30min、60min、120min 3个时间点于心尖部取适量的标本，经冲洗、滤干、以及固定等操作以后，应用石蜡进行包埋。制作成组织切片，以4-5μm为最佳。然后进行苏木精-伊红染色，于光镜下观察组织的病理学改变。

1.5ELISA法测定心肌组织Apelin及APJ蛋白表达 将所取的标本于-70℃的条件下保存。在进行检测时，首先将标本放置于醋酸中，并将醋酸的浓度固定于0.1mol/L，不需要太多，2ml即可，加热至100℃，并持续大约10min，然后应用离心机进行离心，条件为：3000r/min，时间大约持续15mim，然后取上层的提取液。应用ELISA法进行Apelin蛋白含量的测定（计量单位为浓度ng/L)及APJ蛋白含量(计量单位为浓度ng/ml），整个过程中要注意操作的流程一定要规范，可以参考试剂盒的说明进行。

1.6统计学分析 将所得的实验数据录入，并应用SPSS 13.0软件进行对比与分析。计量资料用均值±标准差（x±s）表示，组间的分析采用方差分析，组内的分析应用SNK-q检验，P<0.05代表差别具备统计学意义，P＞0.05代表差别不具备统计学意义。

2　结果

2.1窒息后新生鼠的一般情况 窒息组及药物组实验鼠均表现为懒动、少吃。正常组新生鼠因未窒息缺氧，无上述表现。各组均无动物死亡。

2.2心肌组织病理学形态观察（见图1）

图1　新生鼠心肌组织HE染色结果（×放大倍数）

2.3各组新生鼠血清CK浓度变化（见表1）

表1　新生鼠血浆CK浓度比较：（x±s，单位U/L）

2.4各组新生鼠血清LDH浓度变化（见表2）

表2　新生鼠血浆LDH浓度比较：（x±s，单位U/L）

2.5ELISA法检测心肌组织Apelin的结果 （见表3）

表3　新生鼠心肌组织Apelin蛋白含量的比较：（x±s，单位ng/L）

2.6ELISA法检测心肌组织APJ的结果（见表4）

表4　新生鼠心肌组织APJ蛋白含量值比较：（x±s，单位ng/ml）

3　讨论

新生儿窒息是新生儿期危害极大的常见病，可引起新生儿致残甚至死亡；新生儿窒息多数是由多因素共同作用的结果，也可由单一病因引起[4]。窒息后缺氧缺血可导致各脏器损伤，除脑损伤外[5]，其中合并心肌损伤在儿科临床较为常见[6]，近年来进一步探索窒息缺氧所致缺氧缺血性心肌损伤机制及药物防治已成为研究热点。

本实验通过建立新生鼠常压窒息模型，观察实验鼠窒息后一般情况，测定血清CK、LDH等水平变化，并结合HE染色光镜下心肌病理形态学的改变，通过药物益母草碱进行干预，从整体水平评估窒息新生鼠心肌损伤情况及药物的心肌保护作用。本研究发现，相比于正常对照组：模型组、药物组实验鼠均表现为懒动、少吃；血清CK、LDH水平升高，各时间点均高于正常对照组，且随着缺氧缺血时间延长呈上升趋势。与模型组相比：药物组血清CK、LDH水平显著下降，心肌损害程度明显减轻，证实了益母草碱对窒息缺氧诱导的在体未成熟心肌损伤具有一定的保护作用，并进一步探讨了可能的机制。

Apelin是近年来发现的一种生理调节肽，目前发现其主要是由脂肪细胞分泌，在循环系统中发挥主要的作用并具有重要的价值。目前对于Apelin在心血管疾病中的表达及作用，所得研究结论存在分歧。Tycinska等[7]、申健等[8]报道心梗患者循环apelin水平降低。与此相反，在缺氧的条件下，新生鼠体内的Apelin含量上升、表达增多，从而推测Apelin可能发挥代偿性作用。与Heo K等[9]临床观察基本一致。国内张志等[10]通过制备在体和离体心肌缺血模型，证实在缺血早期，心肌组织Apelin含量代偿性增高，长时间缺血时表达下降，此现象说明在发生心肌缺血尤其是在突发的条件下，内源性Apelin可以保护机体不受损伤；Rastaldo和Tempel等通过研究表明，Apelin对心肌局部缺血发挥保护作用，是通过促进新生血管、限制梗死面积等途径实现[11，12]。本实验研究结果表明，窒息新生鼠心肌组织Apelin早期表达增加，60min达高峰，120min后表达较前下降。推测早期心肌缺血，Apelin作为保护性因子，在心肌缺氧/缺血病理情况下，代偿性表达增加以对抗心肌损害，但随着时间推移，可能因代偿不足而表达下降。

Zeng等[13]通过研究发现，在离体心肌缺血/再灌注大鼠模型中，缺血再灌注可引起APJ受体表达上调，外在给予Apelin后可明显改善缺血/再灌注引起的心肌收缩及舒张功能障碍，可能与心肌组织中APJ受体表达上调有关。此外有研究表明，从某种意义上来说，缺氧可以诱导APJ mRNA和蛋白的表达，也有助于耐缺氧能力的提升[14]。本实验研究结果表明心肌组织APJ的表达与Apelin一致，均呈现早期升高，晚期下降的曲线变化，表明早期心肌细胞缺氧缺血可以导致APJ的表达升高。窒息新生鼠心肌缺氧缺血损伤病理生理过程中，内源性Apelin/APJ可能发挥代偿性保护作用。

中药研究报道银杏叶提取物、灵孢花子粉、参附汤抗大鼠心肌缺血损伤的机制可能与其增加心肌组织Apelin mRNA的表达，提高Apelin水平有关[15-17]。但本实验结论与之相反，推断益母草碱可能并非直接通过上调Apelin/APJ系统蛋白表达的机制发挥对未成熟心肌缺氧缺血性损伤的保护作用，可能与益母草碱的生物学作用相关，也可能是因为益母草碱进一步抑制了Apelin/APJ蛋白的代偿性表达，从而导致Apelin/APJ蛋白含量下降。但其具体机制尚不明确，尚需进一步实验研究。