类风湿关节炎患者关节滑膜液miR-203和MMP-3表达及其临床意义

杨喜永 刘雅文 赵小燕 武崇文 郑锡铭

类风湿关节炎（RA）是一种病因复杂、受多因素影响，以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性、自身性免疫疾病，主要侵害关节滑膜和组织软骨[1，2]。miR-203作为一种小片段单链非编码RNA，在转录后水平抑制mRNA的翻译来调控靶基因的蛋白表达，与包括自身免疫性疾病在内的多种疾病的发生密切相关[3]。基质金属蛋白酶3（MMP-3）作为蛋白水解酶家族的一员，在RA 的发病过程中，能够降解关节软骨，促进血管生成，临床上可用于滑膜损伤、病情严重程度和预后的评估[4]。本研究旨在探讨关节滑膜液miR-203和MMP-3在RA患者中的表达及其临床意义。

1　材料与方法

1.1研究对象 选取2016年11月～2017年5月我院住院的RA患者60例，均符合2010年美国风湿病学会及欧洲抗风湿病联盟 (ACR/EULAR)共同修订的RA诊断标准[5]，其中男18例，女42例；年龄26～63岁，平均(45.8±6.7)岁。统计患者28关节肿胀数（SW28）、28关节压痛数（T28）、总体健康评定（GH），计算 DAS28，DAS28＜2.6为稳定组，DAS28＞2.6为活动组，其中稳定组30例，活动组30例。选取我院同期健康志愿者30例作为对照组，年龄28～58岁，平均(45.1±8.3)岁。选取的研究对象均排除其他自身免疫性疾病和重要器官系统疾病，两组一般资料比较无统计学差异。以上样本的收集均获得患者知情同意及医院伦理委员会同意。

1.2主要试剂及仪器 自动免疫分析仪、自动血沉分析仪检测(Beckman Coulter公司)。Small RNA试剂盒(TaKaRa公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒、qRT-CR荧光定量试剂盒、Nano-Drop17(赛默飞公司)；Analytic jena荧光定量PCR仪(伯乐公司) 。所有引物均由上海生工公司合成。

1.3方法

1.3.1Small RNA提取及cDNA合成 患者及健康志愿者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，1 000r/min离心10min，取上清液置-20℃保存备用。按试剂盒操作说明书提取Small RNA作为模板，使用茎环特异性引物，参照Thermo Scientific反转录说明书进行cDNA合成，反转录条件为42℃，60min，70℃ 5min，4℃保存。

1.3.2标准曲线构建及RT-PCR检测 以miR-203 mimics作为标准品，倍比稀释构建10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 浓度梯度，取标准质粒 2μl作为模板，与样本同时行反转录和RT-PCR，构建标准曲线。采用Top Green qPCR SuperMix反应体系：Top Green qPCR SuperMix 10μl，上、下游引物各1.0μl，模板 2μl，加水至 20μl。反应条件为：95℃30s 1 个循环；95℃ 5s，62℃ 30s ，72℃ 30s 40 个循环；设置3个平行复孔，检测结果取平均值，以标准曲线法进行qPCR定量分析。

1.3.3临床指标检测 ELISA法检测关节滑膜液MMP-3及外周血RF和ACCP抗体，魏氏法检测血沉（ESR），免疫比浊法检测 C 反应蛋白（CRP），所有操作严格按照仪器及配套试剂说明书进行。

1.4统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据采用±s表示，所有数据采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。Pearson相关系数分析各检测指标的相关性。

2　结果

2.1关节滑膜液miR-203、MMP-3及相关临床指标的表达 相对于对照组，RA患者关节滑膜液miR-203、MMP-3及血浆RF、ACCP、ESR和CRP表达显著升高，见表1。

表 1 miR-203、MMP-3 及相关临床指标的表达（±s）

表 1 miR-203、MMP-3 及相关临床指标的表达（±s）

注：-表示未统计

项目　RA组（n=60）　　对照组(n=30)　t　P miR-203(cope/μl)　2418.46±268.991622.46±555.22　9.188　＜0.001 MMP-3(ng/L)216.96±38.67　147.90±37.39　8.075　＜0.001 RF(IU/ml)　46.24±28.80　4.16±2.54　5.999　＜0.001 ACCP(IU/ml)　74.55±43.62　4.16±2.54　8.805　＜0.001 ESR(mm/h)　42.22±27.27　10.70±4.29　6.273　＜0.001 CRP(mg/ml)　31.97±12.15　3.14±1.28　12.919　＜0.001 DAS28　4.183±1.63　-　-　-

2.2关节滑膜液miR-203、MMP-3及相关临床指标在不同时期的表达水平 活动期患者关节滑膜液miR-203、MMP-3及血浆 RF、ACCP、ESR和 CRP表达水平高于稳定期，见表2。

表2　不同时期miR-203、MMP-3及相关临床指标的表达（±s）

表2　不同时期miR-203、MMP-3及相关临床指标的表达（±s）

项目　　活动期（n=30）　稳定期(n=30)　t　P miR-203(cope/μl)　2609.30±245.462227.62±107.72　7.799　　＜0.001 MMP-3(ng/L)234.70±36.05　199.22±33.03　3.974　　＜0.001 RF(IU/ml)　63.26±27.90　29.21±17.60　5.653　　＜0.001 ACCP(IU/ml)　95.95±33.73　53.15±42.26　4.335　　＜0.001 ESR(mm/h)　45.40±24.15　39.03±30.16　0.903　0.370 CRP(mg/ml)　39.95±7.66　23.98±10.49　6.732　　＜0.001 DAS28　5.93±1.17　3.72±1.25　7.065　　＜0.001

2.3miR-203及MMP-3与临床指标相关性分析Pearson相关分析显示：关节滑膜液miR-203与MMP-3、RF、ACCP、ESR、CRP及DAS28显著相关；关节滑膜液MMP-3与RF、ACCP、ESR、CRP及DAS28存在显著相关性，见表3。

表3　miR-203、MMP-3与其他临床指标的相关性分析

2.4miR-203和MMP-3的 ROC曲线分析 为评估关节滑膜液miR-203和MMP-3对RA的诊断价值，对其表达量进行ROC分析，见表4。miR-203诊断临界值为2 162.68(cope/μl)时，灵敏度为98.33%，特异度为83.33%； MMP-3诊断临界值为155.95 (ng/L)时，灵敏度为86.67%，特异度为93.33%。见图1。

表4　RA患者miR-203、MMP-3、ACCP、RF的ROC曲线分析

图 1 关节滑膜液 miR-203、MMP-3、ACCP、RF 的ROC曲线分析

3　讨论

miRNA是近年来发现的一类小片段单链非编码RNA，在转录后水平抑制mRNA的翻译来调控靶基因的蛋白表达，参与多种炎性反应过程和自身免疫性疾病的发病过程，在多种炎性和自身免疫功能调节过程中发挥着重要作用[6，7]。Stanczyk等[8]发现，RA患者滑膜组织中miR-203上调表达，并促进MMP-1和IL-6的表达，其中IL-6的高表达受NF-κB信号通路的影响，表明miR-203通过NF-κB信号通路对滑膜组织发挥作用，同时miR-203可以增加MMPs的产生，在关节破坏方面发挥重要作用。

作为基质金属蛋白酶（MMPs）家族的重要成员，MMP-3可以加剧炎症反应、分解破坏细胞内皮基膜，降解蛋白聚糖等非胶原的基质成分，促进骨的重建及血管翳的形成[9]。在RA早期就有大量成纤维细胞和软骨细胞一起分泌MMP-3，使得滑膜液和血液中MMP-3明显升高，促进血管翳的形成，侵蚀关节软骨，引起骨组织的破坏，同时MMP-3的活化可以使MMP-9产生级联放大效应，加剧炎性反应[10]。有研究发现，MMP-3可预示早期RA患者在检测该项指标增高6～12个月内可出现关节不同程度的破坏[11]。

本研究结果显示，RA患者关节滑膜液miR-203、MMP-3的水平高于对照组，且活动期的表达水平高于稳定期，表明其水平变化对于临床了解患者的病情具有一定指导意义；miR-203、MMP-3与RA传统诊断指标RF、ACCP、ESR和CRP及疾病活动监测指标DAS28存在显著正相关，说明关节滑膜液中miR-203、MMP-3参与了RA的炎症反应，其水平可直接反映患者的关节炎症和破坏情况，且两者存在显著正相关 （r=0.678，P＜0.001）。 miR-203高表达可以促进IL-6的生成，后者可以上调MMP-3的表达[12]。这提示可以通过干预miR-203的表达水平进而调节MMP-3表达，从而为RA提供新治疗手段。

通过ROC曲线分析发现，RF曲线下面积为0.884，以20.00 IU/ml作为诊断临界值时，诊断灵敏度和特异度分别为71.67%和86.67%， ACCP曲线下面积为0.936，以5.00 IU/ml作为诊断临界值时，诊断灵敏度和特异度分别为83.33%和96.67%，均与检测试剂盒一致。关节滑膜液miR-203和MMP-3曲线下面积分别为0.905和0.913，表明其对RA具有很强的临床诊断能力，联合检测具有更强的临床诊断价值。

综上所述，本研究发现关节滑膜液miR-203和MMP-3在RA患者中存在差异表达，其表达水平可作为疾病活动有效监测指标及潜在诊断指标。miR-203可上调MMP-3表达，在疾病过程中发挥重要作用，但由于本组临床样本数量较少，有待于进一步大样本进行验证，以便为RA提供新的临床诊断指标和潜在治疗的新方向。