鼠骨髓间充质干细胞移植对溃疡性结肠炎大鼠结肠的修复作用研究*

高福来　纪桂贤　张利利　李莉　崔红梅

(秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛 066000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是指发生在结肠和直肠的一类慢性非特异性炎症，病变局限于肠粘膜及粘膜下层，患者表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便等[1]。有文献报道[2]，UC患者发生结直肠癌的风险随着患病时间会显著升高，30年后可达18%。癌症是UC患者死亡的主要原因。近年来UC在我国的发病率也有明显升高趋势。由于其病因及发病机制尚不明确，临床没有特异性治疗方法，主要采用对症治疗，效果一般，患者病情易反复，且迁延不愈，严重影响患者健康和生活质量[3]。陈巧玲等[4]研究采用重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后，评估MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性，为鼠骨髓间充质干细胞的进一步应用提供了借鉴。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有多向分化能力的干细胞[5]，通过不同的条件干预，能够分为神经元、干细胞、成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞等，在细胞替代治疗和基因治疗中具有重要的临床价值，但是国内外对于BMSCs治疗溃疡性结肠炎的研究较少。故在本次研究中，通过对UC模型大鼠采用骨髓间充质干细胞移植治疗，观察其对大鼠结肠的修复作用，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料雄性BALA/c健康大鼠80只(SPF级)，8周龄，体重151～200g，购自凯学生物科技(上海)有限公司，许可证号：NO.0152068。所有大鼠分笼饲养1周，环境条件为20～24℃，相对湿度55%～60%，自然光照周期。

1.2试剂胎牛血清，购于Invitrogen公司；DMEM培养基，购于Thermo公司；PBS缓冲液，购于Solarbio公司；葡聚糖硫酸钠(DSS)，购于MP Biomedicals公司；D-乳酸(D-LAC)、二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒，购于Sigma公司；IL-6、IL-10、TNF-αELISA试剂盒，购于北京百奥莱博科技有限公司；髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；淋巴细胞分离液，购于天津灏阳生物有限公司。

1.3仪器石蜡切片机，购于LEITZ公司；光学显微镜，购于洛阳惠尔纳米科技有限公司；组织捣碎匀浆机，购于天津博天胜达科技发展有限公司；台式离心机，购于湖南赫西仪器装备有限公司；自动酶标仪，购于昆山吉和力仪器有限公司；超净工作台，购于苏州净化设备仪器公司。

1.4方法

1.4.1细胞提取取2只大鼠，采用10%的水合氯醛450mg/kg进行腹腔麻醉，腿部消毒，无菌条件下切开皮肤、肌肉，将两侧股骨分离取出，置于无菌纱布上，除尽股骨上的软组织，剪掉股骨两端。使用5ml注射器抽取2ml肝素生理盐水，从一端插入骨髓腔，冲洗出骨髓，收集骨髓于无菌离心管内。然后离心处理，3000r持续5min，弃去上清液，加入3ml生理盐水重悬；再取一个无菌离心管，加入密度为1.092的大鼠淋巴细胞分离液12ml，取3ml骨髓细胞悬液加入此管内，离心处理，3000r持续20min，此时管内分4层，从上向下吸取第2层液体，置于无菌离心管内，用5ml无菌血清DMEM培养液洗涤，再次离心，3000r持续5min，弃去上清液，加入2mlPBS缓冲液；取16μlPKH26加入一个装有2mlDihentC的离心管内，然后将骨髓细胞混合悬液加入此管中，孵育5min，缓慢摇匀，加入4ml胎牛血清，孵育1min，加入8mlDMEM培养液洗涤，离心，3000r持续10min，弃去上清液，用DMEM继续洗涤3次，弃去上清液，加入6ml生理盐水重悬。

1.4.2大鼠分组与造模选择75只大鼠，按照随机数字表法，将其分为正常组、模型组、低浓度组、中浓度组和高浓度组各15只。正常组大鼠给予正常饮食水饲养。其余4组大鼠建立UC模型：将DSS溶于蒸馏水中，配制成5%DSS溶液，给予大鼠饮用1周，然后给予大鼠蒸馏水饮用1周，如此反复4次，UC模型建立。低、中、高浓度组大鼠采用尾静脉注射BMSCs悬液0.4ml，细胞浓度分别为0.5×106/ml、1×106/ml和2×106/ml。模型组和正常组大鼠尾静脉注射0.4ml生理盐水。正常饮食水饲养。每组大鼠在移植后第0、7、21d各处死5只大鼠，对相关情况及指标进行观察检测。

1.5观察指标①大鼠活动和体征的观察：记录大鼠每天体重、大便性状和便血情况，并采用疾病活动指数(DAI)进行评分，每项分为0～4分，总分12分，分数越高，大鼠病情越严重。②大鼠血清相关指标的检测：抽取大鼠内眦静脉血2ml，离心处理，取上清液即为血清，使用检测试剂盒，按照说明书操作，检测TNF-α、IL-6、IL-8、D-LAC、DAO含量。③病理切片的制作：将大鼠处死后，取距离肛门10cm以上的结肠组织，使用10%甲醛固定，常规石蜡包埋处理，切片，HE染色后封片，光学显微镜下观察。④MPO的测定：将大鼠处死后，称取结肠组织，按照重量：体积=1:19的比例加入HTAB缓冲液，制成5%的组织匀浆，然后加入PBS缓冲液，在460nm波长下，测定吸光度值，计算出MPO的含量。

2　结果

2.1各组大鼠结肠组织病理切片观察①正常组大鼠结肠粘膜结构完整，无水肿、溃疡，无炎症。②模型组大鼠结肠粘膜明显减少或消失，充血水肿，有溃疡，大量炎性细胞浸润。③④⑤各浓度组大鼠结肠充血水肿情况好于模型组，溃疡和糜烂减少，炎性细胞减少，并且随着浓度的升高，结肠粘膜结构越好。

图1　各组大鼠结肠组织病理切片Figure 1　Colonic histopathological sections of rats in different groups注：①正常组，②模型组，③低浓度组，④中浓度组，⑤高浓度组

2.2各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比较模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；低、中、高浓度组TNF-α、IL-6、IL-8含量均低于模型组，并且随着浓度的升高，各组TNF-α、IL-6、IL-8含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3各组大鼠不同时间段血清D-LAC含量比较移植后第0d，正常组大鼠血清D-LAC含量明显低于其余各组，差异均有统计学意义(P<0.05)；移植后第7d，模型组与低浓度组大鼠血清D-LAC含量高于其余组(P<0.05)；移植后第21d，低、中、高浓度组大鼠血清D-LAC含量与正常组无差异(P>0.05)，但低于模型组(P<0.05)，见表2。

2.4各组大鼠不同时间段血清DAO含量比较移植后第0d，正常组大鼠血清DAO含量明显低于其余各组，差异均有统计学意义(P<0.05)；移植后第7d，模型组与低浓度组大鼠血清DAO含量高于其余组(P<0.05)；移植后第21d，各组大鼠血清DAO含量均无差异(P>0.05)，见表3。

表1　各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比较Table 1　Comparison of serum TNF-α, IL-6 and IL-8 content of rats in different groups

注：与模型组比较，①P<0.05；与低浓度组比较，②P<0.05；与中浓度组比较，③P<0.05

表2　各组大鼠不同时间段血清D-LAC含量比较Table 2　Comparison of serum D-LAC content in different time periods of rats in different groups

注：与模型组比较，①P<0.05；与低浓度组比较，②P<0.05

表3　各组大鼠不同时间段血清DAO含量比较Table 3　Comparison of serum DAO content in different time periods of rats in different groups

注：与模型组比较，①P<0.05；与低浓度组比较，②P<0.05

2.5各组大鼠不同时间段结肠MPO含量比较移植后第0d，正常组大鼠结肠MPO含量明显低于其余各组，差异均有统计学意义(P<0.05)。移植后第7d，模型组与低浓度组大鼠结肠MPO含量高于其余组(P<0.05)；移植后第21d，各组大鼠结肠MPO含量均无差异(P>0.05)，见表4。

2.6各组大鼠不同时间段DAI评分比较移植后第0、7、21d，正常组大鼠DAI评分均为0，明显低于其余各组，差异均有统计学意义(P<0.05)；移植后第7、21d，各组DAI评分均下降，低、中、高浓度组低于模型组，且随着浓度的升高，DAI评分越低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表4　各组大鼠不同时间段结肠MPO含量比较Table 4　Comparison of colonic MPO content in different time groups of rats in different groups

注：与模型组比较，①P<0.05；与低浓度组比较，②P<0.05

表5　各组大鼠不同时间段DAI评分比较Table 5　Comparison of DAI scores in different time periods of rats in different groups

注：与模型组比较，①P<0.05；与低浓度组比较，②P<0.05；与中浓度组比较，③P<0.05

3　讨论

骨髓间充质干细胞是来自于中胚层的干细胞，主要存在于骨髓中[6],因其具有增殖传代能力强、多向分化潜能、不存在伦理问题和排斥反应等特点，是最有前途的组织工程种子细胞[7]，在不同条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞以及神经细胞分化[8-9]。溃疡性结肠炎发病数近年来有明显增多趋势，患者病程长，病情进行性加重，而且会伴发大量严重并发症，如肠梗阻、肠穿孔、出血等[10]，严重影响了患者的生活质量。由于其病因及发病机制不明，主要认为以炎症免疫机制[7]为主，尽管治疗方法较多，但大多为抗炎对症治疗，缺乏特异性，难以根治。骨髓间充质干细胞具有很强的分化能力，可以通过不同的条件诱导形成多种细胞组织，而且可以向炎症、损伤的组织迁移[12]。有文献报道称[13]，BMSCs还有特殊的免疫特点，可以在异体内存活分化。因此采用BMSCs移植治疗UC的研究也逐渐增多，但对其作用机制的研究相对较少。

正常的肠道内环境的保护作用主要是依靠肠粘膜屏障，由肠粘膜上皮和细胞间连接复合体组成[14]，能够分隔肠腔内物质，防止肠道内菌群失调。其中肠粘膜屏障功能的主要指标是肠道通透性[15]的检测，包括肠粘膜的形态学检查，血液D-LAC和DAO的检测。正常人体内D-LAC含量极低，一方面是自身不合成，另一方面是缺乏代谢的相关酶，主要是由肠道内细菌代谢或裂解产生。当肠道通透性增加时，细菌增多，产生大量的D-LAC进入血液。DAO是肠绒毛上皮细胞的标记酶，当肠粘膜受损时，细胞内的DAO大量入血[16]。两种物质均能够间接反映肠粘膜的损伤程度，从而提示肠道屏障功能。

结肠粘膜细胞作为维持肠道功能的结构基础，UC经常伴随结肠粘膜上皮细胞加速凋亡，而且由于肠道内产生大量的炎性细胞因子以及介质，进一步加剧了损伤肠粘膜屏障功能[17-18]。在本研究中，经过干细胞移植后，观察大鼠结肠镜下切片，发现模型组大鼠结肠粘膜明显减少或消失，充血水肿，有溃疡，大量炎性细胞浸润，提示UC大鼠肠道屏障功能被破坏。低、中、高浓度组大鼠结肠充血水肿情况好于模型组，溃疡和糜烂减少，炎性细胞减少，而且结肠的状态呈明显的浓度相关性，说明干细胞移植能够明显改善UC大鼠肠粘膜损伤情况，修复肠道屏障。模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量明显高于正常组(P<0.05)，说明溃疡性结肠炎的发生发展与炎症反应有关。TNF-α、IL-6、IL-8都是重要的促炎症细胞因子，可由巨噬细胞和T细胞分泌[19]，通过诱导和促进炎症反应，使肠道黏膜屏障被破坏，以至于产生溃疡，而且加强了细胞通透性，引起中性粒细胞大量浸润[20]，加重炎症。低、中、高浓度组TNF-α、IL-6、IL-10含量均低于模型组，并且随着浓度的升高，各组TNF-α、IL-6、IL-10含量均降低(P<0.05)，说明干细胞移植具有抑制炎症反应的作用。移植后第7d，模型组与低浓度组大鼠血清D-LAC、DAO、组织MPO含量高于其余组(P<0.05)；移植后第21d，低、中、高浓度组大鼠血清D-LAC、DAO、组织MPO含量与正常组无差异(P>0.05)，这说明高浓度的干细胞移植治疗，可以明显修复大鼠肠道屏障，起效时间快。MPO是中性粒细胞的一种酶，可以用来反应结肠组织的炎症反应程度[21]。移植后第7、21d，各组DAI评分均下降，低、中、高浓度组低于模型组，且随着浓度的升高，DAI评分越低(P<0.05)，这提示干细胞移植能够改善大鼠病情，缓解肠道症状[22]。

4　结论

采用鼠骨髓间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎大鼠，能够明显改善大鼠病情，其机制可能是通过抑制炎症因子的分泌，从而减轻炎症反应，使肠道屏障功能恢复。但具体的作用机制还需要进一步深入研究。