被动吸烟对大鼠心肌组织 心室结构及血清标志物的影响*

赵佳　江凤　夏纪筑　蒋松辰　王文渊

(西南医科大学附属医院心血管内科， 四川 泸州 646000)

吸烟是人类健康的致命杀手。最新调查发现，截至2015年，全球吸烟人数达10亿，全球十分之一的死亡与吸烟有关[1]。而在我国，现有吸烟人数已超过3亿，同时有7.4亿非吸烟者遭受被动吸烟的危害，每年死于吸烟相关疾病的人数超过100万[2]。目前有临床研究显示，吸烟与低浓度的超敏肌钙蛋白增加相关，表明烟草烟雾中的物质可能损伤心肌细胞[3]。同时Wilson等[4]在对社区动脉粥样硬化风险(Atherosclerosis Risk in Communties，ARIC)研究中对数千名参与者的心脏及其功能进行研究，发现吸烟与心室壁变厚及心脏泵血能力下降存在关联，这两个因素与心衰风险增加相关。本研究通过观察被动吸烟对大鼠心肌及血清标志物的影响，探讨被动吸烟对心脏的危害。

1　材料与方法

1.1实验材料清洁级健康雄性SD大鼠20只，购于西南医科大学动物房；天下秀牌香烟(焦油量：10mg，烟气烟碱量：1.0mg，烟气一氧化碳量：11mg，过滤嘴卷烟)由四川中烟工业有限责任公司出品；脑钠肽(BNP)、大鼠肌钙蛋白T(Tn-T)Elasa试剂盒购于武汉拜意尔生物科技有限公司。

1.2实验分组7周龄SD雄性大鼠20只，体重(200±20)g，按随机数字表法分为两组：实验组10只，对照组10只。

1.3实验方法

1.3.1被动吸烟将大鼠装入自制玻璃装置给予被动吸烟，该装置大小为60cm×50cm×50cm，顶部开有数个1cm×1cm通气口。每天2次，两次间隔6h，每次共燃烧10只烟，持续1h(箱内放置无水氯化钙吸收水蒸气，将2支香烟点燃形成烟雾，并保持均匀，烟雾暴露过程中箱内氧浓度维持在20%)，每周5d，共持续12周。对照组予以正常空气对照。

1.3.2饲养及取材方法两组大鼠采用同等方式饲养于西南医科大学忠山校区动物房，日夜交替。供给大鼠标准动物饲料(购自西南医科大学实验动物中心)和自来水，自由取食水。于4、8、12周时禁食8h后称重，8、12周时麻醉(1%苯巴比妥 40mg/kg)后行小动物心脏彩超，12周时心脏彩超后取血及心脏，心脏经甲醛固定，包埋，行心肌HE染色，血4℃ 2000r离心10min后收集上清液，-80℃冰箱保存备用，检测大鼠血清BNP及Tn-T。

1.3.3心脏彩超检查心室结构大鼠麻醉后固定，应用心脏彩超(VIVID，GE E9 Vingmed ultrasound)探头频率12MHz,取胸骨旁左室长轴切面，在二尖瓣腱索水平记录M型超声运动曲线后，分别测量大鼠左心室舒张末期容积(LVIDd)、左室收缩末期容积(LVIDs)、舒张期室间隔厚度(IVSD)、收缩期室间隔厚度(IVSS)，计算左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)。各指标在连续3个心动周期上测量后取其平均值。

1.3.4血清BNP及Tn-T测定具体操作参照Elisa试剂盒说明书。BNP:在各孔中加入标准品或样品各50μl,立即加入50μl生物素化抗体工作液，37℃孵育45min后洗涤3次，再加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min，洗涤5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl终止液，立即在450nm波长处测量OD值，计算出BNP含量。Tn-T：在各孔中加入标准品或样品各100μl，立即加入100μl生物素化抗体工作液，37℃孵育60min后洗涤3次，再加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min，洗涤5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl终止液，立即在450nm波长处测量OD值，计算出Tn-T含量。

1.3.5HE染色取大鼠心脏，心肌经甲醛固定,石蜡包埋,切片，常规脱蜡至水，先后经苏木素-伊红染色，梯度酒精常规脱水，中性树胶封片等步骤。采用光学显微镜拍照，观察心肌组织病理结构的改变。

2　结果

2.1被动吸烟对大鼠体重的影响与对照组相比，在第8周和第12周时被动吸烟对大鼠体重有显著地抑制作用(P=0.006<0.01或P=0.015<0.05)，但在4周时实验组与对照组大鼠的体重无差异(P=0.098)，见表1。

表1　两组大鼠体重比较Table 1　Comparison of body weight between the two groups

注：与对照组相比，①<0.05，②P<0.01

2.2被动吸烟对大鼠心室结构的影响与对照组相比，实验组大鼠在第12周时具有更大经体重调整后的左室舒张末期容积(P=0.033<0.05)、收缩末期容积(P=0.022<0.05)及室间隔厚度(P=0.016<0.05或P=0.048<0.05)，随着实验时间的延长，被动吸烟组大鼠的左室舒张末期容积增加(P=0.047<0.05)，见表2。

2.3被动吸烟对血清标志物(BNP及Tn-T)的影响与对照组相比，实验组大鼠血清BNP及Tn-T浓度明显增加，差异均有统计学意义(P<0.001)，见表3。

2.4被动吸烟对大鼠心肌的影响对照组大鼠心肌结构正常，横纹清晰，核居中，间质为少量血管及结缔组织，见图1A；实验组大鼠心肌细胞排列紊乱，心室肌细胞纤维分离及纤维部分断裂，血管淋巴细胞浸润，血管内含大量红细胞，见图1B～D。

表2　不同时间两组大鼠心室结构比较Table 2　Comparison of echocardiographic study between the two groups

注：IVSD：舒张期室间隔厚度；IVSS：收缩期室间隔厚度；LVIDd：左室舒张末期容积；LVIDs：左室收缩末期容积；BW：体重；EF：左室射血分数；FS：左室短轴缩短率。与对照组相比，①P<0.05，与不同时间实验组相比，②P<0.05

Table3ComparisonofBNPandTn-Tinsecrumbetweenthetwogroups

指标　对照组　实验组BNP(pg/ml)70.096±4.392106.198±8.453Tn-T(pg/ml)99.414±9.201①156.570±5.341①

注：BNP正常值：<80ng/ml；Tn-T正常值：<110pg/ml。与对照组相比，①P<0.001

3　讨论

图1　两组大鼠心肌的比较Figure 1　Comparison of biochemical histopathological studies between the two groups

吸烟会引起急慢性疾病，最先被熟知的是其与肺部肿瘤的关系。直到19世纪60年代，其与心血管疾病的关系仍具争议。后来研究发现，吸烟是心血管疾病的危险因子。最早研究认为，香烟中的活性物质-尼古丁对交感神经系统有刺激作用，通过增加血压、心率以及心搏量影响心血管系统；还认为吸烟通过血管舒缩障碍、凝血活性异常、血小板激活、白细胞活化、脂质过氧化以及平滑肌增殖导致氧化应激增加炎症及栓塞风险[5-6]。近年有临床研究显示，吸烟与低浓度的超敏肌钙蛋白增加相关，表明烟草烟雾中的活性物质可能损伤心肌细胞[3]；同时有研究发现，吸烟与心室壁变厚及心脏泵血能力下降相关[6]，这两个因素与心衰风险增加相关。

本研究发现，两组大鼠体重在4周时无明显差异(P>0.05)，但在8周及12周时有明显的差异(P<0.05)，提示被动吸烟可能影响大鼠的生长；且随时间的增加，影响越明显。这与梁会鹏等[7]研究结果一致。对于被动吸烟影响体重的具体机制尚不明确，可能与以下因素相关：①香烟燃烧过程中氧气减少，烟雾中CO与血液中的血红蛋白结合，导致机体缺氧，进而导致食欲降低。②烟雾中的尼古丁增加交感神经活性，促进儿茶酚胺释放，增加基础代谢率。有研究表明，尼古丁会通过兴奋交感神经导致糖皮质激素与生长激素增加，从而导致胰岛素抵抗，进而影响代谢，而不是通过影响胰岛素分泌[8]，但是这一结论还存在争议。Moustafa等[9]研究结果显示，吸烟组大鼠与非吸烟组大鼠体重没有明显的变化，这可能是该研究观察时间较短，持续时间仅1个月，而本实验观察时间持续3个月。

通过对大鼠心脏彩超进行分析后发现，8周时两组大鼠心脏结构未出现明显改变。而在12周时，实验组具有更大的经体重调整后的心室收缩末期容积及舒张末期容积(P<0.05)，这与国外学者研究结论相同[10-11]。不同的是，本研究时间较Castardeli短，同时还得出被动吸烟12周，经体重调整后的被动吸烟组大鼠具有更大的室间隔厚度(P<0.05)，虽未能发现其他指标(如EF及FS等)出现明显改变，但发现随被动吸烟时间延长，实验组大鼠左室舒张末期容积增加(P<0.05)，这表明被动吸烟会影响心室重塑的过程。心功能进行性降低是心室重塑的显著特点，同时心室结构改变会促进心功能障碍[12-13]。但本研究并未发现心功能降低，可能是因为早期的细胞生长及重塑有助于维持心功能。我们在进一步研究中发现，被动吸烟4个月后大鼠室间膈及室壁厚度在肉眼观上已经明显比正常大鼠肥厚，但不足的是未行心脏彩超检查。

本研究发现，被动吸烟组大鼠血清BNP浓度较正常空气对照组增加,提示烟草烟雾中的物质促进了BNP分泌或抑制了BNP清除。促进BNP分泌的可能机制为长期香烟烟雾暴露导致机体血压升高，增加心室压力负荷，导致心室分泌BNP增加；同时较高的血压对血管壁存在剪切力，导致血管内皮细胞损伤，促进BNP的释放。Talukder等[14]研究证实，烟草烟雾暴露刺激了交感神经系统，增加了儿茶酚胺浓度，导致血压升高。该研究还证实其能增加氧化应激及降低NO生物利用度，引起内皮功能障碍及心室重构。而目前尚无探讨香烟烟雾暴露是否抑制BNP清除的研究。被动吸烟组大鼠血清TnT浓度较正常空气对照组增加，提示香烟烟雾导致心肌细胞损伤，其机制是烟草燃烧后产生的污染物增加了氧化应激和产生过度的自由基，故推测可能是氧化应激产生的炎症因子及过度的自由基导致了心肌细胞损伤[15]。Ambrose等[16]研究表明，香烟烟雾导致氧化应激表现为炎症和栓子形成，机制是通过血管舒缩障碍、促凝过程、血小板激活、白细胞活化和平滑肌增殖而实现的。

本研究对大鼠心肌病理检测发现，被动吸烟会引起心室肌细胞纤维分离及纤维的部分断裂，血管淋巴细胞浸润及血管内充血，这与文献报道符合[17]。Hariri等[18]研究发现，于香烟烟雾暴露1个月后出现心肌肥厚、炎症、纤维化、动脉粥样硬化、主动脉钙化的改变，本研究也得到了部分结论。该研究还发现，氧化应激的程度与冠脉疾病严重程度相关，并导致血管疾病、动脉粥样硬化和高血压的进展。Talukder等[14]研究表明，继发于吸烟的高血压、心脏肥大和重塑的原因是心血管系统氧化应激的增加；吸烟会导致心室细胞超微结构的改变，如心肌细胞线粒体损伤、部分破坏或者消失，从而影响Z线[17]。本研究发现被动吸烟导致心室结构的改变，推测其机制可能是通过香烟燃烧产生的有毒物质导致氧化应激及过度的自由基损伤心肌细胞；同时血压升高引起血管内皮损伤及增加压力负荷，导致BNP及肌钙蛋白的改变。但其具体机制仍需进一步的研究证实。

4　结论

本研究结果显示，长期被动吸烟会导致心肌组织、心室结构改变及影响血清标志物浓度，影响心室重塑。而因为烟草燃烧产生的烟雾中许多有毒的成分已被证明可以引起炎症、过敏、窒息、癌变，如尼古丁、焦油、苯、甲醛、苯并芘、一氧化碳、氰化物及丙烯醛等，所以本研究存在局限性，特别是由于方法学原因，所采取被动吸烟方式引发造成大鼠的心肌组织、心脏功能及损伤标志物的变化因素较多，可能为上述有害成分的综合作用结果。所以，下一步研究可进一步在细胞学、分子结构方面探讨其毒理学机制。