DC-CIK生物治疗后肺癌患者Pro-GRP和T淋巴细胞亚群对免疫功能评价的临床意义

何丽杰，冯贺强，褚相南，吕玉洋，张贺平

（天津市第五中心医院 检验科，天津 300450）

肺癌是目前世界上发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一[1]。世界卫生组织发布的《World Cancer Report 2014》指出肺癌仍是最普遍和最致命的癌症。在中国，随着空气污染等问题的日趋严重，每年肺癌新发病例为67.6万，死亡病例为56.5万，均居世界各国肺癌发病率和死亡率的第1位。由于小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）临床上表现为高度恶性，肿瘤增长较快，早期即发生区域淋巴结转移、复发及远处转移，约70%的肺癌患者在确诊时已经属于晚期，大部分患者丧失手术机会，转而接受常规的化疗、放疗，而放化疗的不良药物反应和耐药性让很多患者难于接受。在过去的20年中，生物免疫治疗被认为是一种新的“绿色疗法”逐渐受到关注，其治疗的原理是体外扩增效应细胞（如NK细胞、DC细胞、CIK细胞等），通过回输效应细胞，刺激机体的免疫应答，依赖效应细胞本身的高杀伤活性及自体的免疫系统共同抗击肿瘤细胞。DC-CIK治疗被广泛使用，因为它对多种癌症的高增殖率和细胞毒活性，简单而温和的培养期，很少有不良反应且提高患者满意度和依从性[2]。

本实验基于DC-CIK生物治疗的研究，通过收集肺癌患者未治疗前和经生物治疗1个月后血，监测治疗前后免疫功能、肿瘤标志物等的变化，探讨DC-CIK细胞治疗对肺癌患者的治疗效果，明确其对肺癌患者免疫功能的影响。本研究将对肺癌患者的支持治疗及改善生活质量具有积极意义，可为临床规范应用DCCIK细胞治疗肺癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年9月-2015年8月天津市第五中心医院就诊的肺癌患者45例，其中，男性31例，女性14例；年龄43～86岁，中位数62岁。所有患者均经过病理学确诊，其中小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）13例，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）32例，所有患者均为首次来院就诊，均无其他免疫相关性疾病，且不合并其他恶性肿瘤，检测前未接受过放化疗及免疫治疗。对照组选取同时期健康体检者40例，其中，男性22例，女性18例；年龄56～64岁，中位数60岁。放化疗、生物治疗前清晨空腹采集患者肘正中静脉血5 ml，胃泌素释放肽前体（Pro-gastrin-releasing peptide, Pro-GRP）采用分离胶促凝管，T淋巴细胞亚群及调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）采用EDTA-K2抗凝血，采血后立即送检验科4 h内检测完毕。

1.2 仪器与试剂

电化学发光免疫分析仪Cobas E601（德国罗氏诊断有限公司），FC500流式细胞仪（美国贝克曼-库尔特公司），血细胞分离机（美国FRESENIUS KABI公司），Pro-GRP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSENSE）、细胞角蛋白19的可溶性片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）检测试剂盒（德国罗氏诊断有限公司）。四色淋巴细胞亚群CD45-FITC/CD4-RD1/CE8-ECD/CD3-PC5、CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5、溶血素（OptiLyse C）Flow Count计数微球、0.01 mol PBS溶液、Immuntrol质控血（美国贝克曼-库尔特公司）。

1.3 实验分组

生物治疗前Pro-GRP、T淋巴细胞亚群分3组，即对照组、SCLC组、NSCLC组。生物治疗后分两组，即SCLC组、NSCLC组。

1.4 实验方法

1.4.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1检测在LIS系统输入患者信息，受检者外周血的Pro-GRP、CEA、NSE、CYFRA21-1按照仪器及试剂使用说明书要求上机检测，将结果分组记录。

1.4.2 T淋巴细胞亚群检测 将样本编号并录入实验室信息系统（LIS），准备与样本相同数量流式细胞管并编号，在已编号流式细胞管中各加入10 μl四色抗体，涡旋混匀，室温避光放置15～20 min；在已编号流式细胞管中用反向加样法分别加入100 μl全血，取出试管，每管加入500 μl Opti Lyse C溶血素并立涡旋混匀2 s，20～25℃避光孵育10 min；在流式细胞管中加入500μl PBS，室温平衡5 min；取出Flow-Count荧光微球，涡旋震荡器匀10～12 s，以反向加样法在各管中加入100 μl荧光微球（荧光微球的加样量与样本量一致），充分混匀，2 h内上机检测；登录至LIS并复核转录是否正确。

1.4.3 Treg细胞检测 取静脉血100 μl加入已编号流式细胞管，分别加入CD4-PE标记CD25-FITC标记的荧光单克隆抗体20 μl，涡旋混匀，室温避光放置15～20 min，加入细胞裂解液4 ml，涡旋混匀，室温避光放置10 min待红细胞完裂解，离心取上清，加入2 ml PBS洗涤2次，上机检测。

1.4.4 DC-CIK细胞生物治疗 血细胞分离机循环外周血4 000～5 000 ml，采集肿瘤患者外周血，循环4次，循环血量根据患者身高、体重等而定，采集外周血35 ml，单个核细胞数大约为1×108个，采血袋酒精消毒后，于传递窗送入细胞制备室（百万级GMP标准试验间），进行密度梯度离心，无菌制备PBMC，37℃孵育2～4 h，将悬浮细胞移出，贴壁细胞中，补充有1 000 u/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和1 000 u/ml IL-4的培养基，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，第4天补充上述细胞因子，第6天加入携带多抗原Ad5型腺病毒，MOI=5，负载DC，第7天加入TNF-α，负载DC成熟，制备成DC疫苗。吸取悬浮细胞，用含INF-g的2%自体血清的完全培养基悬浮，调整细胞梯度至密度为2×106个/ml，接种于75 cm2培养瓶中，24 h后，向培养液中加入CD3单抗、重组人IL-2及重组人IL-1，诱导生成大量CIK细胞，每2天更换1次培养液，培养10～14 d后，根据细胞扩增情况，收集CIK细胞并用生理盐水洗涤2次。然后将细胞悬浮于含有20 g/L人血清清蛋白的100 ml生理盐水中，并静脉输注给患者，细胞量每次＜1×1010个，活力＜95%，每周回输1次共回输3次，回输前对细胞培养液取样进行细菌、真菌、支原体和内毒素检测，回输后以相同方法采集外周静脉血检测Pro-GRP和T淋巴细胞亚群。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验，生物治疗前后比较选用配对样本t检验，相关性分析采用Pearson检验，各组数据分别服从正态分布，且方差齐性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1在肺癌中的表达

Pro-GRP在SCLC组中高表达，有时甚至可高达5 000 pg/ml，对照组与SCLC组、NSCLC与SCLC组间Pro-GRP水平比较差异有统计学意义（t=3.304和-3.290，P =0.006），对照组与NSCLC组Pro-GRP水平比较差异无统计学意义（t=-5.860，P =0.052）；Pro-GRP和NSE在SCLC组的表达高于NSCLC组，CYFRA21-1在NSCLC组的表达高于SCLC组，CEA在各组表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 DC-CIK生物治疗前后Pro-GRP、T淋巴细胞亚群水平的比较

NSCLC组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达增高，CD8+、Treg细胞表达降低；而SCLC组治疗后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表达增高。Treg细胞表达降低；两组治疗后的Pro-GRP水平与治疗前比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），均低于治疗前。见表2。

2.3 DC-CIK生物治疗前后两组T淋巴细胞亚群的变化

DC-CIK细胞生物治疗后NSCLC组CD8+淋巴细胞和Treg细胞较治疗前降低，CD3+、CD4+淋巴细胞、CD4+/CD8+比值较治疗前上升；SCLC组CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞数量较治疗前均增加，Treg细胞两组均较治疗前降低。见图1～5。

2.4 DC-CIK生物治疗前后Pro-GRP与T淋巴细胞亚群相关性分析

SCLC组Pro-GRP治疗前与CD3+、CD4+、CD8+、呈负相关，与Treg细胞呈正相关，治疗后也存在相关性（P＜0.05）；在NSCLC组Pro-GRP与CD3+、CD4+、CD8+无相关，只与Treg细胞呈正相关。见表3。

表1 各组肺癌患者血清肿瘤标志物检测水平的比较 （±s）

表1 各组肺癌患者血清肿瘤标志物检测水平的比较 （±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05

组别Pro-GRP /（pg/ml）CEA/（ng/ml）NSE/（ng/ml）CYFR21-1/（ng/ml）对照组（n =40）34.93±16.082.93±1.368.66±2.081.57±0.75 SCLC组（n =13）1 943.71±208.53†13.49±2.7680.83±10.57†17.79±4.36 NSCLC组（n =32）47.69±24.1165.05±19.5117.79±4.3624.68±6.47†F值31.3202.48015.6753.123 P值0.0010.0910.0010.049

表2 DC-CIK细胞治疗前后Pro-GRP、T淋巴细胞亚群水平的比较 （±s）

表2 DC-CIK细胞治疗前后Pro-GRP、T淋巴细胞亚群水平的比较 （±s）

组别CD3+ /%CD4+ /%CD8+ /%CD4+/ CD8+Treg/%Pro-GRP/（pg/ml）NSCLC组（n =32）治疗前59.6±3.631.7±2.827.3±3.61.2±0.215.0±3.947.69±24.11治疗后62.3±3.835.8±2.623.8±1.91.5±0.111.7±4.037.13±15.23 t值10.43112.516-3.1097.120-6.132-3.915 P值0.0010.0010.0040.0010.0010.032 SCLC组（n =13）治疗前49.4±12.125.8±5.923.8±6.21.1±0.19.0±1.21 943.71±208.53治疗后59.2±9.930.9±5.428.4±4.91.2±0.17.6±1.1430.23±67.14 t值4.6995.1983.9511.213-8.153-3.911 P值0.0010.0010.0020.0410.0010.001

图1 SCLC组治疗前后T淋巴细胞亚群比较

图2 NSCLC组治疗前后T淋巴细胞亚群比较

图3 NSCLC组治疗前后T淋巴细胞比

图4 SCLC组治疗前后T淋巴细胞比

图5 两组治疗前后Pro-GR水平比较

表3 DC-CIK生物治疗前后Pro-GRP与T淋巴细胞亚群相关系数

3 讨论

肺癌是一种原发于肺、气管及支气管的恶性肿瘤。恶性肿瘤患者普遍存在免疫功能低下，免疫细胞不能有效识别、排斥和杀灭肿瘤细胞，T淋巴细胞及亚群是机体关键性免疫活性细胞，在免疫监视、杀伤靶细胞及免疫调节方面具有极重要的作用[3]。当肺癌患者T淋巴细胞及其亚群数量发生变化或CD4+/CD8+细胞比值异常时，可视为免疫调节功能紊乱。

CD3+细胞反映机体总的细胞免疫状态，一般为CD4+与CD8+细胞数之和。肺癌患者免疫功能紊乱或低下，细胞免疫功能处于抑制状态，CD3+细胞减低。本研究显示，DC-CIK细胞回输生物治疗后，患者体内的淋巴细胞亚群发生明显变化，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较治疗前上升，DC-CIK生物治疗增加IFN-g、IL-2细胞因子的分泌，促进CD4+的分化和增殖，CD4+淋巴细胞辅助诱导其他淋巴因子抑制肿瘤细胞增生[4]，分泌IL-2、IFN-g、TNF-β等细胞因子杀伤肿瘤细胞，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞抑制肿瘤基因表达，以达到抑制肿瘤病毒的繁殖，使肿瘤细胞生长停滞，诱导肿瘤细胞凋亡[5]来调节机体其他免疫细胞的功能。本实验结果显示，NSCLC组SCLC组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+治疗前后的比较，表达增高证明DC-CIK免疫治疗调节患者的免疫功能，提高患者的抗肿瘤免疫水平，恢复肺癌患者的免疫监视功能。

抑制T细胞CD8+通过分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子，直接对抗原呈递细胞产生细胞毒效应，通过独特型网络抑制B细胞产生抗体[6]，本实验显示，NSCLC组CD8+细胞在生物治疗前后的比较结果下降，证明DC-CIK细胞抑制CD8+细胞的负向调节，CD8+细胞数量减少有利于抑制肿瘤持续增长[7]，但是在SCLC组CD8+在生物治疗后上升，两组比较有差异，可能原因CD8+细胞根据是否表达CD28分为毒性T细胞和抑制T细胞，前者具有细胞毒性功能，后者具有免疫抑制功能[8]，这使得CD8+细胞具有双相调节功能，两者的相互作用在NSCLC和SCLC表达有差异，并且SCLC肿瘤恶性程度较高，广泛浸润导致免疫监视功能停滞，T淋巴细胞已基本丧失免疫功能，无法快速恢复至正常水平，导致两者在CD8+细胞表达有差异，具体原因还需要进一步的研究。

当肿瘤发生免疫逃避时，Treg细胞通过分泌IL-6和IL-17细胞因子，诱导STAT3转录因子的活化，从而抑制CD4+和CD8+细胞及DC细胞的活化和增殖，DC-CIK生物治疗前后NSCLC组与SCLC组Treg细胞较治疗前下降，说明DC-CIK生物治疗降低Treg细胞表达、逆转Treg细胞对肿瘤患者的免疫抑制作用，从而增强患者免疫识别和杀伤功能。

本研究采用电化学发光方法检测Pro-GRP，实验显示Pro-GRP和NSE在SCLC组高于NSCLC组，早期的实验报道证明Pro-GRP在SCLC组中具有高表达[9]，Pro-GRP对SCLC诊断的特异性和敏感性高于NSE[10-11]。本实验也证明Pro-GRP可以作为一种特异的SCLC肿瘤标志物，在患者未经治疗前显示出较高的水平，治疗后呈现下降趋势，在SCLC组降低更加明显。SCLC组Pro-GRP治疗前与T淋巴细胞亚群呈负相关，与Treg细胞呈正相关，即Pro-GRP越高T淋巴细胞亚群数值越低，说明SCLC患者的Pro-GRP越高其免疫调节功能越差，免疫抑制越强，而在NSCLC组并无相关性，研究证明Pro-GRP可以作为SCLC患者免疫功能的临床评价指标，在治疗过程Pro-GRP的下降可以提示患者免疫功能变化，还需要扩大标本量，进行更深一步的研究。

综上所述，DC-CIK生物治疗增强患者特异性杀伤肿瘤的能力，提高机体的免疫监视功能，抑制肿瘤免疫逃逸，改善患者的免疫功能。DC-CIK生物治疗提高传统化疗肺癌患者的疗效，增强抗肿瘤效果[12-15]。然而，DC-CIK疗法是目前不用于肺癌常规治疗，主要因为细胞疗法需要个体化成本较高，因此，降低DCCIK疗法的成本使其将来可提供给更多的患者。