P13K-Akt-HIF-1α信号通路在右美托咪定减轻大鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用

刘小平 朱小兵 吴 论

1.广东省中山市石岐苏华赞医院麻醉科，广东中山 528402；2.广东省中山市中医院麻醉科，广东中山 528400

呼吸机相关性肺损伤是呼吸支持治疗中机械通气相关性并发症之一，常见于重症医学中[1-2]。有关研究表明，呼吸机相关性肺损伤与过度牵拉肺泡导致肺血管内皮细胞激活相关信号转到通路，引起炎性反应有关[3-7]。有研究提示右美托咪定可以减轻呼吸机相关性肺损伤，机制可能与其可抑制炎性反应相关[8-9]，但其抑制炎性反应的具体信号通路尚不明确。另外动物实验研究，提示右美托咪定肾保护作用可能与P13K/Akt信号通路有关[10]。缺氧诱导因子-1α 是内源性保护机制的始动因子和共同途径，是P13K/Akt信号通路的下游因子[11]。评价磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子-1α信号通路在右美托咪定减轻大鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用，探讨其减轻VILI的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

成年雄性SD大鼠60只，体重300～350g。随机将其分为4组（n=15）：对照组（C组）、机械通气组（V组）、右美托咪定组（D组）和右美托咪定+LY294002组（DL组）。

1.2 模型制备

20%乌拉坦溶液麻醉后，股动脉穿刺置管术，测动脉压，股静脉输注乳酸钠林格氏液10mL/（kg·h）；气管切开气管导管，机械通气2.5h，C组保留大鼠自主呼吸，其余三组大潮气量，高频率通气；D组于术前10min内静脉输注完右美托咪定（批号：13040932，江苏恒瑞医药有限公司）5μg/kg后，以2.5μg/（kg·h）的速率输注至实验结束；PI3K抑制剂LY294002输注方法参考文献[5]，DL组给予右美托咪定前静脉注射LY294002（批号：Y1503s，碧云天生物技术研究所）0.3mg/kg，输注时间5min，其余注射等量生理盐水。

1.3 实验指标

于机械通气前（T0）、机械通气结束时（T1）、机械通气结束30min（T2）时血气分析后，记录RI和OI；取左肺组织，匀浆后，采用双抗体夹心ELISA法（Santa CmZ公司），检测TNF-α、IL-6和IL-10的含量；取右肺中叶组织，称湿重（W），烘干，称干重（D），计算肺W/D比值。取右肺组织，甲醛固定24h，行石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织形态的改变。取右肺前叶，抽提蛋白，Westrern-blot方法检测P-Akt和HIF-1α的表达，参考文献[5]的方法采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至聚乙烯二氟膜，滤膜封闭，分别加入抗p-Akt一抗（Santa Cruz 公司，美国）和抗HIF-1α，4℃过夜，TBS洗膜后，过氧化物标记的二抗，以β-actin为内参。发光与显色后，采用凝胶扫描成像系分析图像，以灰度值与β-actin积分光密度指的比值反映P-Akt和 HIF-1α的表达[5]。

1.4 统计学方法

所以数据应用SPSS14.0统计软件处理，多组计量资料采用F检验， 组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 呼吸指数及氧合情况比较

与C组比较，其余三组T1、T2时RI升高，OI降低；与V组比较，D组和DL组T1、T2时RI降低，OI升高；DL组RI较D组降低、OI增高。见表1～2。

表1 四组大鼠不同时点呼吸指数比较（±s，n=12）

表1 四组大鼠不同时点呼吸指数比较（±s，n=12）

注：与C组比较，aP＜0.05；与V组比较，bP＜0.05；与DL组比较，cP＜0.05

组别 T0 T1 T2 C组 0.30±0.08 0.27± 0.05 0.30±0.03 V组 0.29±0.07 4.60±0.20a 7.17±0.11a DL组 0.31±0.07 3.81±0.05ab 6.78±0.02ab D组 0.33±0.02 1.00±0.11abc 1.57±0.07abc F 0.25 2.95 7.58 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V与DL比较） 1.32 4.74 10.2 t（V与D比较） 0.95 6.25 58.2 t（D与DL比较） 1.02 4.68 42.5 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 四组大鼠不同时点氧合情况比较（±s，n=12）

表2 四组大鼠不同时点氧合情况比较（±s，n=12）

注：与C组比较，aP＜0.05 ； 与V组比较，bP＜0.05 ；与DL组比较，cP＜0.05

组别 T0 T1 T2 C组 475±40 485±30 464±34 V组 476±38 237±28a 245±34a DL组 473±29 305±26ab 309±28ab D组 458±29 330±24abc 372±30abc F 0.27 2.75 2.70 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t （V与DL比较） 0.06 3.87 4.87 t（V与D比较） 0.21 9.25 10.24 t（D与DL比较） 0.17 3.51 6.54 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 肺组织炎性因子比较

与C组比较，其余三组肺组织TNF-α、IL-6、IL-10含量及W/D比升高；与V组比较，D组和DL组肺组织TNF-α、IL-6 、IL-10含量升高，W/D比降低（P＜0.05）；DL组肺组织TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量较D组高（P＜0.05）。见表3。

表3 四组大鼠肺组织IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比较 （±s，n=12）

表3 四组大鼠肺组织IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比较 （±s，n=12）

注：与C组比较， aP＜0.05；与V组比较， bP＜0.05；与DL组比较，cP＜0.05

组别 W/D TNF-α（pg/g） IL-6 （pg/g） IL-10 （pg/g） HO-1 C组 4.30±0.20 87.8±22.8 10.7±3.0 34.2±22.4 0.009±0.001 V组 6.22±0.47 184.0±22.5a 20.9±3.4a 93.9±11.2a 0.090±0.020a DL组 5.45±0.32 234.5±16.4ab 27.3±2.6ab 173.5±15.5ab 0.150±0.030ab D组 5.14±0.23 110.2±12.5abc 13.1±2.8 abc 240±12.3 abc 0.335±0.050 abc F 0.215 2.68 3.25 2.71 2.98 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V与DL） 1.43 2.52 6.2 16.2 23.04 t（V与D） 1.55 3.58 6.5 30.3 32.5 t（D与DL） 1.10 5.68 11.2 12.3 20.2 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 P-Akt和HIF-1α表达比较

与C组比较，P-Akt表达下调和HIF-1α表达上调（P＜0.05）；与V组比较， P-Akt和HIF-1α表达上调（P＜0.05）。DL组肺组织较D组P-Akt和HIF-1α表达上调（P＜0.05）。见表4。

表4 四组大鼠肺组织P-Akt和HIF-1α表达水平

3 讨论

呼吸机相关肺损伤在临床上不不少见，尤其在重症医学监护室情况多见。研究和探讨减少这种损伤的方法和机制有一定的临床价值。此前有报道称右美托咪啶可以减轻呼吸机相关肺损伤，但是它的相关可能机制并不清楚，有必要进一步研究并明确它的机制。所以我们研究中参考文献[12]成功建立呼吸机相关性肺损伤动物模型。我们的结果也提示，机械通气可以诱发了大鼠呼吸机相关性肺损伤。

过去公开报道中提到TNF-α是一种急性肺损伤的启动因子，它通过诱导NO，内皮素、氧自由基等的产生导致肺损伤[13]。我们研究中参照文献[14]，结合人体动物剂量换算公式，最终选择右美托咪定的给药为术前10min静脉输注右美托咪定5μg/kg，再2.5μg/（kg·h）的速度静脉给药。本研究结果表明，与DL组比较，D组肺组织TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量升高，RI降低、OI升高，DL组损伤程度高于D组，但仍低于V组，提示右美托咪定可减轻大鼠呼吸机相关性所致肺损伤，LY294002可部分抑制右美托咪定的肺保护作用。

本研究结果表明，相对C组来看，V组肺组织p-Akt表达情况下调，此结果间接提示呼吸机相关性肺损伤有可能与PI3K/Akt信号通路参与有关系；相对于V组来比较，我们发现D组肺组织p-Akt表达情况上调。LY294002是PI3K的特异性抑制剂，它通过靶向抑制PI3K的催化亚基pll0，再则减少靶分子PDK和Akt的活化[15]。此次研究给予LY294002完，我们发现DL组肺组织p-Akt表达水平较D组低许多，间接告诉我们LY294002可以有效地抑制P13K/Akt信号通路，进一步确认右美托咪定减轻肺损伤和它抑制PI3K/Akt信号通路有关系。

我们还发现，p-Akt与HIF-1α的变化趋势一致，进一步确认HIF-1α的表达与PI3K/Akt信号通路有一定的关系，右美托眯定的上述作用可能与PI3K-Akt-HIF- 1α信号通路有关。

另外我们也发现，同V组来看，DL组肺损伤较低，此结果间接提示PI3K-Akt-HIF-1α通路抑制剂并不能完全抵消右美托咪定的作用，这一有趣现象告诉我们，在PI3K-Akt-HIF-1α通路以外的有其他分子通道亦可能也参与了右美托咪定的肺保护作用。

通过本次实验研究，我们可以得出这样的结论：右美托咪定可能通过影响P13K-Akt-HIF-1α信号通路进而减轻大鼠呼吸机相关性肺损伤。