IGFBP-6蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达意义

胡　威　李浩勇　梁培育　程　帆　张孝斌

肾细胞癌是成人肾脏最常见的肿瘤。透明细胞肾癌(ccRCC)是肾癌最常见的病理类型，占75%，其次是非透明型，包括乳头状瘤(10%)、嫌色细胞瘤(5%)和其他罕见类型等[1]。肾细胞癌具有很高的死亡率和发病率，泌尿生殖系统肿瘤中稳步上升，全球每年新发病例约为20万例，超过10万例患者死亡[2]。肾部分切除术或者根治性肾切除是该疾病的1种有效治疗手段，但晚期肾细胞癌仍然是非常致命的，5年生存率约为53%[3]。ccRCC的发病机制一直是肾肿瘤研究领域的热点，深入探索ccRCC的发生发展的分子机制及找到相关的治疗靶点是近年来该研究领域的前沿。

IGFBP-6是1个相对较新的IGFBP家族成员，已有研究表明其在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[4-8]，但在肾细胞癌中的作用尚未见报道。本研究旨在探讨IGFBP-6的表达在人类ccRCC组织中的区域特征和空间分布，这将有助于我们了解IGFBP-6在人类CCRCC中的潜在作用。

1　材料与方法

1.1　标本采集

所有34例患者均在武汉大学人民医院行原发肾肿瘤切除术，均为单侧根治性肾切除，并被我院病理科明确认定为肾透明细胞癌，根据临床及病理表现。纳入标准：患者有腰痛、血尿等症状，或在常规身体检查时发现并诊断为肾肿瘤，通过全腹部CT定性为肾原发肿瘤，并排除继发于其他器官的肿瘤。

组织病理学诊断标准：ccRCC标本切片进行HE染色，肿瘤细胞的细胞胞质透明或为嗜酸性粒细胞；组织间可见小的薄壁血管组成的网状间隔；一些肿瘤细胞呈现为巢和腺泡结构；少数肿瘤成分肉瘤样结构，巨细胞偶尔可见，提示预后差；少数肿瘤可见坏死、纤维粘液化、钙化、骨化。标本收集等过程经我院医学伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。患者的肿瘤组织及配对癌旁组织取至同一手术标本，及时收集储存并用液态氮冷冻。

1.2　免疫组化检测

组织经石蜡包埋切片成5 μm厚的切片，免疫组织化学(IHC)根据Liang等[9]公布的方法分析。组织切片，经3%过氧化氢孵育10 min，在黑暗中，在室温下，以淬灭内源过氧化物酶活性。然后进行抗原检测。随后，在37°C下与正常的血清，切片，然后用一抗孵育(1∶200，IGFBP-6抗体，美国Santa Cruz公司)原抗(1∶50，美国Santa Cruz公司)在4 ℃过夜。在室温下反应15 min，PBS洗涤后，切片，以过氧化物酶标记抗体在37 ℃ 40 min后，接着用一个3′-二氨基联苯胺底物溶液反应和Mayer苏木精复染。IGFBP-6染色的组织阳性细胞百分率被定义如下：0分为无染色(-)；1～3分为弱阳性(+)，4～6分为中度阳性(++)，而≥7分代表强阳性(+++)。

1.3　实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测

IGFBP-6在ccRCC及其ANCT组织中mRNA的表达是由ABI 7300 RT-PCR分析系统完成。引物，CypD ：5′-gaggggctcaaacactctacg-3′(上游)和5′-ccatccgatccacacacca- 3′(下游)；β-actin：5′-gtggacatccgcaaagac-3′(上游)和5′- aaagggtgtaacgcaacta-3′(下游)。反转录反应为1 μg，总RNA从每个组的细胞中分离。采用SYBR绿色荧光RT-PCR Master Mix扩增cDNA(Takara)和引物进行PCR扩增。从94 s开始，在30°C下进行扩增，再反应40个周期(94 ℃ 下 30 s,60 ℃下 60 s, 72 ℃下60 s)。所有的反应进行3次，并应用ABI 7300系统SDS软件分析mRNA的比值。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　IGFBP-6 在ccRCC组织及其配对的ANCT组织中的表达

在ccRCC组织及其配对的ANCT组织中IGFBP-6的mRNA及蛋白表达水平有显著差异。在ANCT组织中，mRNA表达水平为(1±0.2)，明显低于ccRCC标本的(3.6±0.6)(P<0.01)(图1)，根据相应的免疫反应强度，在ANCT组织中，IGFBP-6免疫反应平均得分为(0.4±0.2)，具体得分10例为+，1例为+++，这明显低于ccRCC组织的平均得分(2.8±0.4)(P<0.001)(具体得分8例为++，26列为+++)。IGFBP-6阳性表达显著增强，两者差异有统计学意义(P<0.001)。

图1　ANCT组织和ccRCC标本中IGFBP-6 mRNA的表达

2.2　IGFBP-6表达与ccRCC临床病理特征的关系

IGFBP-6表达与患者年龄、性别无显著相关性，同时IGFBP-6表达与肿瘤TNM分期，肿瘤体积大小及淋巴结有无转移无明显相关性，见表1。

表1　IGFBP-6表达与ccRCC临床及病理特征相关性/例

3　讨论

IGFBP-6是1个相对较新的IGFBP家族成员，其主要介导细胞的坏死，其与IGF-Ⅱ(胰岛素样生长因子-Ⅱ)的亲和力IGF-Ⅰ (胰岛素样生长因子-Ⅰ )强大约50倍[10]。其这1特点使它成为1个非常有力的IGF-Ⅱ活性抑制剂，其对IGF-Ⅱ依赖性的肿瘤生长产生抑制作用[4-5]，如神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤和结肠癌[6-8]等已有文献报导。但在肾细胞癌中的作用尚未见报道。IGFBP-6除了可作为选择性的抗癌治疗靶点。同时，IGFBP-6可以调节细胞分化和延缓细胞衰老[8,11]。先前的一些研究表明IGFBP-6是通过结合IGF-Ⅱ蛋白和阻断IGF/insulin(胰岛素/胰岛素样生长因子 )信号通路的转导来发挥作用。这其中也包含了IGF家族的独立功能[9,12]。同时IGFBP-6是1个选择性的抗癌治疗靶点，也可以调节细胞分化和延缓细胞衰老。基于本文中我们主要的实验结果，免疫组化及RT-PCR，IGFBP-6 mRNA及蛋白在ccRCC组织中的表达均远高于其对照的癌旁组织，差异有统计学意义。

研究发现，IGFBP-6 在肝细胞癌组织水平中表达均高于癌旁组织，并提出该蛋白可能是肝癌的1种新的肿瘤标志物[13]。IGFBP-6已经证实对许多肿瘤细胞系中胰岛素样生长因子功能有抑制作用。IGFBP-6在乳腺癌中的表达，可通过不同的方式来调节乳腺癌细胞生长，如增加IGF的生物有效性或降低IGF抑制剂作用等[14]。 但是到目前为止，IGFBP-6 在ccRCC中的作用及其与ccRCC发生发展的关系并无报导。

本研究首次报告了IGFBP-6 在ccRCC组织及其癌旁组织中的表达存在差异，有统计学意义。 由此推测，IGFBP-6可能与ccRCC的发生、发展有着密切关系。同时我们还发现IGFBP-6的表达与患者性别、年龄以及肿瘤的TNM分期，肿瘤大小、淋巴结转移等因素无相关性。这些结果表明IGFBP-6的表达与ccRCC的发生呈正相关性。但是由于我们的临床样本量有限，其所涉及的具体机制等，例如细胞死亡途径或其他信号转导通路等将在后续研究。