小干扰RNA抑制树突细胞瘤苗白细胞介素-10受体对食管癌细胞免疫效应的研究进展

朱晓磊，　朱自江，　王文昊，　庞瑶，　脱广鑫

食管癌是我国最常见的致死性恶性肿瘤，其中鳞状细胞癌占90%以上，男性发病率是女性的3～4倍[1-2]，我国食管癌患者占全世界总数一半以上。早期食管癌患者临床表现不明显，出现吞咽困难等症状就诊时已处于中晚期，甚至已有全身性转移，尽管采用手术切除联合放疗、化疗药物的综合治疗，但其5年生存率仅为5%～14%[3-8]。因此，寻找治疗食管癌更高效安全的综合治疗方式具有深远的临床意义。肿瘤的发生、发展是多因子参与、多步骤的复杂生物学过程，若从免疫学角度分析，是因为肿瘤细胞逃逸了机体免疫清除的结果。癌基因激活和抑癌基因失活、肿瘤细胞MHC的功能改变、肿瘤抗原丢失以及低表达、T淋巴细胞活化所需的刺激因子功能的异常等都可使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视进一步增殖，甚至转移。所有肿瘤免疫应答的治疗经过了多种途径激发机体自身的免疫应答，从而增强机体免疫应答水平，达到控制或消灭肿瘤细胞的目的。肿瘤细胞本身具有一定的抗原性，能够引起机体自身免疫应答反应，能否提高肿瘤细胞本身免疫的抗原性，激发机体抗肿瘤特异性及非特异性的免疫应答水平是抗肿瘤免疫治疗的重要思路。肿瘤瘤苗的设计及治疗策略能很好地满足这一要求，成为肿瘤生物治疗领域中的研究热点[9-12]。有研究发现，食管癌进展、侵袭及预后都和树突细胞(dendritic cell，DC)在食管癌组织及周围癌性淋巴结内的密度和分布及功能障碍密切相关[13-15]。已有动物实验证实，DC瘤苗在小鼠体内有显著的抗肿瘤效果，相关临床研究也取得了一定的效果[16]。但传统瘤苗效果欠佳，可能与其分化抑制有关。其中，白细胞介素-10(IL-10)是其中免疫抑制作用比较强的一种抑制因子，几乎所有的DC细胞和单核巨噬细胞都是IL-10抑制性作用的靶细胞[17-19]。通过小干扰RNA技术[20-22]抑制树突细胞IL-10受体的表达，培养IL-10受体缺失的树突细胞，进而制备负载食管癌细胞抗原的树突细胞，制备负载了食管癌细胞抗原的高效DC瘤苗，提高了DC瘤苗抗肿瘤作用，能够为结合食管癌抗肿瘤的免疫治疗和基因靶向治疗提供新思路。现就小干扰RNA抑制树突瘤苗IL-10受体对食管癌细胞免疫效应做一概述。

1　树突细胞(dendritic cell，DC)

1.1DC与抗肿瘤作用树突细胞(dendritic cell，DC)为一种骨髓来源的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，能够在机体自身免疫反应的诱导、调控中发挥重要作用，为T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的免疫反应过程中关键的调控之一，也是迄今为止发现的最高效的抗原提呈细胞[13-15，23-24]。目前人类外周血DC的两个亚群主要为髓样DC(myeloid dendriticcell，MDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cell，PDC)，分类依据主要为细胞表型及其功能。髓样DC主要发挥抗原提呈功能并分泌IL-12，引起Th1免疫应答进而促进细胞免疫；其中浆细胞样DC主要作用是引起Th2介导的自身免疫应答反应，进而促进机体自身体液免疫应答。因DC形态和功能的独特性，所以有关DC的研究进展很快，尤其是在体外研究中应用了细胞因子大量扩增DC获得成功后，DC研究成为免疫学抗肿瘤研究中不断升温的热点之一。目前DC的研究热点是其能够通过抗原提呈，从而调控细胞免疫应答反应；由DC激活的T淋巴细胞介导的CTL免疫应答在机体自身抗肿瘤过程中起主导作用[15，24]；所以，髓样DC的加工、处理和提呈抗原的功能是机体能否完成抗肿瘤反应最为关键的步骤。有研究发现，应用DC进行抗肿瘤自身免疫治疗机制包括：①DC摄取肿瘤细胞的抗原，进行加工、处理后再提呈给CD4+T细胞，从而使之活化再抗肿瘤；或是提呈给CD8+T细胞后产生了特异性细胞毒性T细胞而发挥抗肿瘤效应。②DC还可以通过表达肿瘤细胞表面高水平的组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子而提呈肿瘤细胞抗原肽，进而使相应的T细胞受体能够被充分占据；同时，DC提供高水平B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40等许多协同刺激分子，使T细胞能被充分激活。③DC还可以通过合成、分泌某些细胞因子进而发挥抗肿瘤作用，例如IL-12。而由IL-12诱导的T细胞和NK细胞能产生许多肿瘤坏死因子、颗粒酶和穿孔素，从而导致肿瘤细胞溶解[13-15，23]。近年来，DC抗肿瘤瘤苗研究以及应用备受关注，在肾癌、前列腺癌、黑素瘤和肺癌等肿瘤中，以DC为基础的抗肿瘤瘤苗在动物试验研究中，甚至临床Ⅰ、Ⅱ期研究中已取得令人欣慰的研究成果[15，25-29]。

1.2DC与食管癌的发生、进展和治疗有研究表明，肿瘤患者体内DC数量减少及功能缺陷可能与肿瘤发生发展、转移及预后有着密切的相关性。Kikuchi等[30]通过对DC在肿瘤的原发灶、邻近组织、局部淋巴结等处分布的情况进行综合分析，发现DC在体内分布情况与患者总生存率、无瘤生存率和肿瘤复发时间具有一定的相关性。Yilmaz等[31]发现肿瘤患者体内DC数量和肿瘤临床分期、周围浸润呈一定负相关性。然而，最新研究发现，尽管在肿瘤微环境中有足量DC浸润，但这些DC缺乏一定的提呈肿瘤细胞抗原的能力，甚至更易于凋亡，从而丧失DC本身该有的提呈抗原和激活T淋巴细胞免疫反应的功能[32]。Lu等[33]通过对DC体外研究的实验已证明，若在培养液中加入一定量食管癌组织匀浆后，DC形态能被明显抑制，DC表面CD86，CDla和CD11c表达都明显下调，它能够活化T淋巴细胞能力，CTL毒性有明显下降，以上说明食管癌模拟的肿瘤微环境能明显抑制DC发育、分化等。Nagao等[34]将负载了食管癌抗原的DC活化的淋巴细胞在皮肤下转移灶内进行局部注射，从而发现皮肤下转移灶缩小，提示DC可用于肿瘤局部治疗或是辅助治疗。对于食管癌进展期患者，Yamana等[35]尝试用负载了SART-1肽DC瘤苗、活化的自身淋巴细胞进行抗肿瘤免疫治疗，结果发现DC瘤苗治疗的临床疗效很差。Fujiwara等[36]发现，在食管癌化疗期间，如果在肿瘤组织内部注射一定量成熟的DC细胞并没有有效地向引流淋巴结迁移，可能无法达到较好的临床效果。通过体外扩增DC和运用各种形式肿瘤细胞抗原修饰的DC，以增强DC抗肿瘤疗效已成为当前抗肿瘤免疫研究的热点。

2　IL-10的免疫抑制

恶性肿瘤都有一个非常重要的生物学特征，那就是荷瘤机体长期处在免疫抑制的状态，限制了DC抗肿瘤瘤苗对肿瘤的治疗效果。目前研究证实，恶性肿瘤细胞的抗原性差，MHCⅠ和Ⅱ类抗原表达低，甚至能分泌多种抑制性因子如IL-10、前列腺素E2(PGE2)等，而IL-10是其中免疫抑制作用较强的一种，几乎所有DC细胞和单核巨噬细胞都是IL-10抑制性作用的靶细胞[17-19]。有研究证实，IL-10生物学活性一般通过IL-10与其靶细胞膜上受体特异性结合来实现，IL-10受体包括两类，分别为IL-10R1和IL-10R2；IL-10通过与细胞膜上相应的IL-10受体特异性结合来实现IL-10所有生物学功能。目前已用原位杂交的方法证实了多种人类恶性肿瘤发生时，肿瘤细胞能够产生大量IL-10，例如，食管癌、肾透明细胞癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌等[18-19，37-39]。IL-10强烈的免疫抑制作用包括：① 大多能诱导未成熟协助性淋巴细胞(Th0)向Th2细胞分化，抑制Th1细胞生成。Th2细胞自身产生一定量IL-6、IL-4、IL-10 均能促进肿瘤细胞产生IL-10，直接刺激肿瘤细胞快速生长，故形成恶性循环。② IL-10能抑制单核/巨噬细胞(Mc/Mφ)系统产生IL-1αβ、IL-12、TNFα、GM-CSF，抑制T细胞及NK细胞产生TNFβ、IFNγ及IL-2，并促进MC/Mφ、NK及T细胞产生IL-10。无反应性T淋巴细胞更能产生TGFβ，从而加强机体免疫抑制效应。体外试验已证明，抗IL-10抗体可以中和IL-10，从而恢复带瘤动物体内Mφ产生IL-12能力。给荷瘤动物体内注射抗IL-10抗体，能恢复动物抗肿瘤能力，并使血清IFNγ及TNF含量升高5～15倍。③ IL-10还可抑制许多APC对肿瘤性抗原的趋化反应，并抑制APC膜上MHC-Ⅰ、Ⅱ分子及CD80、(B7-1)、CD86、(B7-2)的表达，进而抑制APC向T细胞表面TCR提呈抗原和对T淋巴细胞共同刺激的作用，致使刺激信号不能很好传入T淋巴细胞，使T淋巴细胞始终处在无反应状态，导致免疫系统应答低下。近年来如何改善抗肿瘤治疗疗效的研究转向如何能够打破机体自身肿瘤细胞免疫耐受的状态，进一步克服甚至逆转机体自身免疫抑制，诱导机体自身对肿瘤细胞产生主动免疫应答杀伤肿瘤细胞。

3　小干扰RNA

RNA干扰(RNA interference， RNAi)是在进化过程中高度保守、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发、同源mRNA高效特异性降解的现象。近年来发现研究生物体内基因表达、调控和功能的最新技术特点是利用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起生物细胞内同源性基因特异性沉默现象，本质是siRNA与其对应的mRNA能够特异性结合和降解现象，进而阻止mRNA翻译过程[23-25]。

由于RNA干扰技术的发现不仅能提供经济、快捷以及高效的抑制基因表达，更可能为基因功能测定及基因靶向治疗等方面开辟新思路。通过小干扰RNA抑制树突细胞IL-10受体表达，再培养IL-10受体缺失的树突细胞，进而制备负载食管癌细胞抗原树突细胞高效瘤苗，以提高DC瘤苗的免疫活性[22，40-43]。

4　展望

DC作为机体免疫应答过程中的一种专职APC，其本身就具有抗肿瘤免疫功能，已被广泛应用在实验性抗肿瘤治疗过程中，对DC的研究具有良好的临床应用前景。然而，由于DC抗肿瘤免疫治疗过程中的复杂性，目前仍有许多问题需要解决，包括DC在食管癌患者体内形态的改变、功能的减退、肿瘤抗原的负载方式和免疫治疗最佳途径及时间间隔等。由于肿瘤免疫逃逸机制非常复杂，包括DC数量、功能和形态变化，以及T淋巴细胞和NK细胞等功能的变化，肿瘤微环境对免疫应答中的影响等，都需要进一步研究。通过小干扰RNA抑制DC的IL-10受体表达，培养IL-10受体缺失的DC，进而制备负载食管癌抗原的DC，制备负载食管癌细胞的DC高效瘤苗，以提高DC瘤苗的免疫活性。为食管癌患者抗肿瘤的免疫治疗和基因靶向治疗提供新思路。应用IL-10受体缺失的DC瘤苗有可能成为食管癌生物治疗一种新型有效的方法。