不同类型红曲黄酒中挥发性风味组分比较分析

郭伟灵, 周文斌, 蒋雅君, 刘绘鹏, 3, 李 路, 刘 斌, 饶平凡, 倪 莉, 吕旭聪,

(1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心, 福建 福州　350002； 2.福建农林大学食品科学学院, 福建 福州　350002； 3.永春县市场监督管理局, 福建 泉州　362600; 4.福州大学食品科学技术研究所, 福建 福州　350116)

0　引言

红曲黄酒是我国的一种传统发酵酒, 具有几千年的历史和独特的工艺, 被誉为“中华国粹”, 是我国最具民族特色的酒精饮料之一[1-2].红曲黄酒是在蒸熟的糯米冷却后, 添加红曲作为生物发酵剂, 在多种微生物共同作用下发酵而成, 其不仅富含营养成分, 又因添加红曲进行发酵而具有独特的功效[3-5].目前, 红曲黄酒主要产地在福建、 浙江和湖北等省, 其中较为典型的有福州青红酒、 乌衣红曲酒、 龙岩沉缸酒、 福建老酒.对红曲黄酒传统酿造用曲(红曲和药白曲)和传统酿造过程中的微生物菌群研究报道较多[6-8].不同地区的黄酒具有特色风味主要在于其挥发性风味组分的不同, 因此分析红曲黄酒中的挥发性香气成分, 了解红曲黄酒的香气特点, 有利于改进红曲黄酒品质.而对于不同地区红曲黄酒中挥发性风味成分差异及其重要风味成分目前尚未见报道.

固相微萃取技术具有流程简单、 效率高和精准度高等优点, 广泛应用于食品、 环保、 药物、 天然产物等领域[9-11].近年来, 采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC/MS)技术解析酒香气组分的报道逐渐增多, 其中对葡萄酒、 白酒和啤酒等的挥发性香气组分已有报道[12-13].本研究以检测出挥发性组分总峰面积为主要评价指标, 对红曲黄酒中挥发性香气物质的萃取条件进行优化, 并采用HS-SPME-GC/MS方法来分析和比较不同地区红曲黄酒, 进一步进行主成分分析找出重要的挥发性物质和独特香气物质, 探究红曲黄酒传统酿造过程挥发性物质的变化规律.

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

福州青红酒、 乌衣红曲酒、 龙岩沉缸酒、 福建老酒分别购自不同红曲黄酒酿造酒厂； 2-辛醇购自美国Fluka公司； 其他试剂均为国产色谱纯或分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司.

1.2　仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪7890A/5975MSD, 购自美国Agilent公司； DB-Wax弹性石英毛细管, 管柱30 m×0.25 mm, 膜厚度0.25 μm, 购于美国Agilent公司； 固相微萃取(SPME)装置、 100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取头、 75 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取头、 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/ CAR/ PDMS)萃取头, 均购于美国SUPELCO公司； 15 mL顶空钳口样品瓶购于上海安谱公司； DF-1型号集热式磁力搅拌器购自金坛市鑫渃实验仪器厂.

1.3　方法

1.3.1固相微萃取条件优化

通过GC-MS分析比较不同萃取纤维头(100 μm PDMS、 75 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS)、 盐质量浓度(0、 0.07、 0.13、 0.20、 0.27、 0.33和0.40 g·mL-1NaCl萃取体系)、 萃取温度(30、 40、 50、 60和70 ℃)及萃取时间(10、 20、 30、 40、 50、 60和70 min), 以色谱出峰总峰面积(乙醇除外)为主要指标, 以质谱鉴定出的化合物种类数为辅助指标, 对各个萃取参数进行优化, 选择较合适的萃取条件用于4种红曲黄酒挥发性风味组分分析.

1.3.2样品处理

萃取头的预处理： 将新购置的萃取头在预先调试过的250 ℃进样口的气相色谱仪老化1 h.

样品处理： 准确量取6 mL经稀释10倍的发酵酒, 并添加2.0 g NaCl和10 μL 2-辛醇(10 mg·L-1), 密封, 将其放于60 ℃水浴锅中预热10 min, 插入老化的萃取头, 萃取吸附45 min.

1.3.3GC-MS分析

将萃取头拔出, 立即插入气相色谱仪, 在进样口温度为250 ℃条件下解吸5 min, 进行GC-MS检测分析.GC条件： 高纯度氦气作为载气, 流速1 mL·min-1； DB-Wax色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm), 不分流进样, 进样口温度250 ℃； 起始温度40 ℃, 保持5 min, 以5 ℃·min-1升至120 ℃, 然后以10 ℃·min-1升至240 ℃, 保留5 min； 后运行温度240 ℃, 后运行时间5 min.MS条件： 接口温度280 ℃； 连接杆温度150 ℃； EI电离源, 电子能量70 eV, 离子源温度230 ℃, 质量扫描范围m/z35～450； ACQ方式Scan.

1.3.4数据分析

定性方法： 将测得物质谱图与NIST11 和Wiley中标准谱图进行检索对比, 并与相关文献报道的挥发性物质描述和保留指数相比较, 确证所检出红曲黄酒香气中的各种化学成分.采用HS-SPME法萃取时, 样品被检测出的图谱应扣除萃取头自身携带的杂质峰, 才能精准分析出4种红曲黄酒中的挥发性成分.挥发性物质半定量方法： 参考宋海燕[14]的方法略有修改, 添加10 μL 2-辛醇(10 mg·L-1)到样品中作为内标, 再利用被测物与内标物面积的比值来计算4种红曲黄酒中的各种挥发性风味物质的质量浓度.

利用SIMCA 14.1软件, 通过一定的程序计算相关系数并列出相关矩阵, 根据相关矩阵求出特征值及其相应的特征向量, 挑选相对较大的特征值及其特征向量, 使其累积贡献率在85% 以上.最后采用SIMCA 14.1软件对酒曲有关成分进行主成分分析, 并以此作散点图.

2　结果与讨论

2.1　固相萃取头的选择

图1　　　　3种不同类型的萃取头对红曲黄酒挥发性风味组分的萃取效果比较Fig.1　　　　Effect of different SPME fibers on the extraction of volatile components in Hong Qu glutinous rice wine

图2　　　　NaCl质量浓度对红曲黄酒挥发性风味组分萃取效果的比较　Fig.2　　　　Effect of NaCl mass concentration on the extraction of volatile components in Hong Qu glutinous rice wine

实验比较3种萃取头分析红曲黄酒挥发性组分, 从中挑选出适合萃取红曲黄酒挥发性风味物质的萃取头, 萃取效果比较见图1.由图1可知, 不同类型的萃取头得到的挥发性组分总离子流色谱图具有显著差异.图中峰的数量与峰的高低均存在较大差异, 其中DVB/CAR/PDMS萃取头的萃取效果明显高于100 μm PDMS 纤维头和65 μm PDMS/DVB纤维头.因此, 采用DVB/CAR/PDMS萃取头萃取红曲黄酒中挥发性组分.

2.2　固相微萃取(HS-SPME)条件的优化

2.2.1盐质量浓度的选择

氯化钠作为常用电解质添加到稀释酒样品中, 能有效降低其溶解度, 提高其挥发性物质进入萃取瓶中上空, 进一步提高萃取头吸附量[9].图2比较了 NaCl质量浓度对红曲黄酒挥发性风味组分萃取效果的影响.由图2可知, 随着萃取时酒样稀释品中氯化钠质量溶度的增加, 检测出的色谱总峰面积(除乙醇外)显著增加.当6 mL稀释10倍的发酵酒中添加氯化钠2.0 g时, 色谱中的峰面积达到最大； 当添加的氯化钠质量大于2.0 g, 峰面积反而有所减少.因此, 在6 mL稀释10倍的发酵液中添加2 g氯化钠最有利于其被萃取.

2.2.2萃取温度的选择

挥发性物质在萃取瓶中处于动态平衡状态, 而温度可以有效地改变到达平衡的时间及平衡时顶空的挥发性物质的浓度.结果如图3所示, 随着萃取温度逐渐升高, 色谱出峰总峰面积也有所增加, 当温度达到60 ℃时, 总峰面积达到最大值； 而当萃取温度大于60 ℃, 总峰面积反而减少.这可能是萃取温度较低时, 液体中挥发性物质无法获得足够能量使其克服液面表面张力运动到顶空； 当萃取温度超过最适温度时, 红曲黄酒中的挥发性风味组分的分配系数会降低, 从而降低涂层上的吸附量[11].因此, 本研究最终选择萃取温度为60 ℃.

2.2.3萃取时间的选择

精准称取2.0 g NaCl置于15 mL样品瓶中, 再加入6 mL稀释的福建老酒酒样(乙醇最终体积分数为2%), 在60 ℃磁力搅拌下预热10 min, 搅拌速度为750 r·min-1, 并在60 ℃下分别萃取10、 20、 30、 40、 50、 60和70 min, GC 解吸5 min.试验结果见图4.

图3　　　　不同萃取温度对红曲黄酒挥发性风味萃取效果的影响Fig.3　　　　Effect of extraction temperature on the extraction of volatile components in Hong Qu glutinous rice wine

图4　　　　不同萃取时间对红曲黄酒挥发性风味萃取效果的影响Fig.4　　　　Effect of extraction time on the extraction of volatile components in Hong Qu glutinous rice wine

由图4可知, 在其他条件不变下, 随着萃取时间增加, 色谱中各峰面积总和(除乙醇外)逐渐增加, 当萃取时间达到及超过60 min后, 色谱总峰面积(除乙醇外)基本上保持不变.原因在于挥发性物质在整个体系(液体、 顶空和萃取头涂层)中处于平衡状态, 即萃取涂层达到饱和状态.其萃取时间过短或延长均不利于其对挥发性物质的分析, 因此最终选择萃取时间为60 min.

2.3　不同红曲黄酒中挥发性香气成分的SPME-GC/MS分析

表1列出了 4种红曲黄酒挥发性风味物质定性定量分析结果, 由表1可知, 红曲黄酒含有较多挥发性香气物质, 但不同红曲黄酒含有的挥发性物质在种类和数量上均有显著性差异, 正因为此种差异, 才造就不同红曲黄酒独特的特征.从结果可知, 4种红曲黄酒共检出49种挥发性风味成分, 包括醇类14种、 醛酮类6种、 酚类1种、 酯类17种、 酸类5种和其他化合物6种.醇类和酯类在黄酒总挥发性物质中占很大比例, 是红曲黄酒中主要香气成分, 对红曲黄酒的风味品质起到关键的作用[15-16].但两种物质形成原因存在较大差异, 其中醇类是黄酒陈化酯类物质的重要原料, 主要来源于糖化酶和液化酶对酿造原料中淀粉的降解和蛋白酶对氨基酸脱氢脱羧[12]； 而黄酒中酯类化合物含量主要由酿造过程微生物菌群、 酿造温度和通氧量等因素共同决定[17], 其赋予酒体花香味和果香味[18-19].

酸类挥发性化合物对红曲黄酒的风味有显著的影响, 具有 “无酸不成酒”[20], 4种红曲黄酒均含有5类酸类物质, 但因其低溶度且挥发性小等特点, 对香性造成不利影响.研究表明, 酸类占黄酒中挥发性物质比例不及醇类和酯类, 但酸对酒香气的贡献主要在于它是产香的前体物质, 能有效增强酒的浓厚感、 降低甜度, 并且起到协助其它香味成分的作用[21].

表1　4种红曲黄酒挥发性风味物质定性定量分析结果

续表1

注： “-”表示该挥发性物质未被检测到

2.4　不同红曲黄酒中挥发性风味组分主成分分析

图5　　　　不同红曲黄酒及其挥发性香气成分主成分分析得分载荷双标图(PC1*PC2)　Fig.5　　　　Biplots of aroma components in different Hong Qu glutinous rice wine (PC1*PC2)

图5为不同红曲黄酒及其挥发性香气成分主成分分析得分载荷双标图.从图5看出, 福州青红酒、 福建老酒、 乌衣红曲酒和龙岩沉缸酒分别位于PCA图的4个不同象限, 说明此4种红曲黄酒香气成分差异具有统计学意义.从PCA图中可知, 福州青红酒分布在第一象限, 与其密切相关的两个挥发性物质是10-甲基-2-癸内酯(Z7)与癸烯(O6)； 福建老酒位于第二象限, 与其较为相关的挥发性物质主要是己酸乙酯(Z2)、 癸酸(S5)、 苯乙醛(Q3)3-吡啶甲酸乙酯(Z14)和癸酸乙酯(Z15)； 乌衣红曲酒和龙岩沉缸酒分别分布在第三和第四象限, 但均远离中心且位于边缘处, 其中, 与乌衣红曲酒密切相关的挥发性香气化合物有己酸(S3)、 辛酸(S4)、 2-庚酮(Q5)、 乙酸(S1)和十九烷(O2), 与龙岩沉缸酒密切相关的挥发性香气化合物主要有3-羟基-2-丁酮(Q6)和乳酸异丁酯(Z16).

图6 为不同挥发性成分对不同红曲黄酒风味特征的贡献度分析.从图6可知, 对福州青红酒风味特征的贡献作用按影响力从大到小依次为苯甲酸乙酯(Z10)、 正己醇(C5)和10-甲基-2-癸内酯(Z7)等； 对乌衣红曲酒风味特征的贡献作用按影响力从大到小依次为2, 3-丁二醇(C10)、 糠醛(Q1)和苯甲醛(Q2)等； 对龙岩沉缸酒风味特征的贡献作用按影响力从大到小依次为棕榈酸甲酯(Z12)、 丁酸(S2)和7-甲基十五烷(O1)等； 对福建老酒风味特征的贡献作用按影响力从大到小依次为1-甲基萘(O4)、 正辛醇(C9)和丙二醇(C13)等.香气活力值大的香气化合物其香气贡献亦大, 因此后续研究还需要采用GC-O时间-强度法及香气活力值法对这些挥发性物质进行了较全面的分析.

图6　不同挥发性成分对不同红曲黄酒风味特征的贡献度分析Fig.6　Contribution analysis of different volatile aroma compositions to different Hong Qu glutinous rice wine

3　结语

根据检测出的挥发性组分数量和质谱离子信号强度, 采用3种不同类型涂层的SPME纤维头, 筛选对红曲黄酒挥发性风味组分具有较好萃取效果的条件.发现50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头较有利于对红曲黄酒中挥发性成分进行分析.对萃取条件进一步优化发现, 在6 mL样品中添加2.0 g氯化钠、 萃取温度60 ℃和萃取时间60 min时, 对其红曲黄酒中挥发性成分分析较有利.

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头, 在最优条件下, 萃取4种不同红曲黄酒(福州青红酒、 乌衣红曲酒、 龙岩沉缸酒、 福建老酒)中的挥发性风味组分并进行分析, 共检测出挥发性物质49种, 福建老酒、 福州青红酒、 乌衣红曲酒和龙岩沉缸酒中检出的主要挥发性化合物分别为41、 36、 29和29种, 以酯类和醇类为主.

对4种不同红曲黄酒中的挥发性组分进行分析, 揭示其挥发性组分差异的统计学意义.通过不同红曲黄酒中不同挥发性物质的对其本身风味特征的贡献度分析, 寻找与其香气特征密切相关的挥发性风味成分.