傣药对叶豆叶中大黄酸的含量测定

卯明霞　陆应彩　彭　霞　姜明辉

(西双版纳州食品药品检验所，云南　景洪　666100 )

傣药对叶豆叶傣语“芽拉勐龙” ，《西双版纳傣药志第二集》也称 “牙郎满聋”、翅叶槐；《云南思茅中草药选》以翅决明、翅果决明、非州木通收载，为豆科植物翅荚决明Cassia alata Linn.的干燥叶。傣医临床常外用[1]于治疗神经性皮炎，牛皮癣，温疹，皮肤瘙痒，疔疮肿疡。文献报道[2]含有:大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-(羟甲基)-O-β-葡萄糖苷、-生育酚、羽扇豆-20(29)-烯-3-酮、β-谷甾醇、2-乙基-3-甲基-马来酸酐、邻二甲氧基对羟基-E-肉桂酸、2,3-二乙酰基丁四醇等化学成分，未见对叶豆叶大黄酸含量测定的有关报道，按《中国药典》2015年版四部通则[3]现建立对叶豆叶大黄酸含量测定方法，为对叶豆叶质量评价傣医临床用药提供参考方法和科学依据。

1　材料

1.1仪器Agilent高效液相色谱仪(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260QuatpumpVL)；岛津UV-2550紫外可见光分光光度计；101-1EBS电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；YB-1A真空恒温干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司)；AE200电子分析天平(瑞士梅特勒)；BL310电子天平(德国赛多利斯)；MS205DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2试剂对照品大黄酸(中国食品药品检定研究院，批号：110757-201607)测定前在YB-1A真空恒温干燥箱中以五氧化二磷干燥12h以上。乙腈、甲醇(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)为色谱纯，水为超纯水(自制)，其余试剂均为分析纯。供试品对叶豆叶采自西双版纳州景洪市、勐海县、勐腊县。由西双版纳州食品药品检验所彭霞主任药师鉴定为豆科植物翅荚决明(Cassia alata Linn.)的干燥叶。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性考察采用Waters Symmetry Shield RP18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)色谱柱，流动相：乙腈-0.1%磷酸盐缓冲液 (45 : 55)为流动相；流速：1 mL/min ；检测波长：430 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl；理论板数以大黄酸峰计不低于3000。色谱图见图1、图2。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备液的制备精密称取大黄酸对照品适量(10.80mg)，置于200mL量瓶中，用甲醇制成每1mL含54μg的溶液，摇匀，即得；(注：大黄酸在甲醇中溶解度较小，因此本实验采用200mL的容量瓶，微加热，即完全溶解)。

2.2.2供试品溶液的制备取供试品粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，称定重量，加热回流1h(约70℃)，放至室温，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察取浓度为54 μg / mL的对照品储备液适量，加甲醇配制成1.35，2.70，5.40，16.20，21.60，32.40，48.60，54.00μg /mL的对照品溶液，摇匀。按上述色谱条件分别进样10 μL ，以对照品浓度为横坐标(X)，对应色谱峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算，得回归方程：Y = 22.063x + 0.1869 ( r2=0.9998)结果表明：大黄酸对照品进样量在1.35～ 54.00μg范围内具良好的线性关系。

2.3.2重复性试验取同一批次的对叶豆叶药材(批号：20170820)6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，依次测定，对叶豆叶中大黄酸的平均含量为0.65mg/g，RSD为0.70%。

2.3.3精密度试验精密吸取大黄酸对照品溶液10μL，重复进样7次，测得峰面积值的RSD为0.50%。

2.3.4稳定性试验取同一批次(批号：20170820)的供试品溶液，分别在0，2，6，12，18，24 h进样，测定峰面积，测得大黄酸峰面积的RSD为1.73%。表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定。

2.3.5加样回收率试验精密称取已知含量的供试品(产地：西双版纳州景洪批号：20170820，含量：0.65mg/g)约0.25 g，平行6份，分别精密加入大黄酸对照品适量，按供试品溶液制备方法操作，测定，计算加样回收率，见表1。

表1　加样回收率试验结果

3　样品测定

按照上述色谱条件，分别测定5个不同产地5批供试品，计算含量，见表2。

表2　不同产地、不同批次的对叶豆中大黄酸的含量(n=2)

4　讨论

本研究采用二极管阵列检测器及紫外分光度计在190～450nm波长扫描，结果在254nm、430nm处有最大吸收，文献报道[4]及《中国药典》2015年版一部大黄项下，大黄酸检测波长是430nm、 254nm，试验中在254nm波长下的峰面积较大，但分离效果差，杂质峰影响大，在430nm波长下杂质成分干扰小，大黄酸峰的分离度大于1.5，确定检测波长为430nm；流动相优选时分别以乙腈-0.1%磷酸(45:55)、乙腈-0. 1%冰乙酸(70 : 30)、甲醇-0.1%磷酸(85 : 15)、乙腈-0.1%甲酸(80:20)为流动相进行考察，结果显示以乙腈-0.1%磷酸(45 : 55)为流动相，样品分离度好，基线较稳定，最终确定此流动相。

本实验考察了如下几种供试品处理方法：乙醇、水、甲醇为溶剂，采用回流提取(提取时间为60min、90min、120min)、超声处理(超声时间为30min、45min、60min)。试验结果表明，以甲醇为溶媒，回流提取60min对叶豆叶中大黄酸的含量较高，杂质干扰少。

另参照中国药典2015年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”(通则9101)，考察了不同柱温(25℃、30℃、35℃)、不同色谱柱：Dikma Diamonsil Plus C18 (250×4.6mm, 5.0 μm)；Agilent ZORBOX SB- C18(150×4.6mm, 5.0 μm)；Waters Symmetry Shield RP18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；不同检测波长(430nm、427nm、433nm)；不同流速(0.8 mL/min、1mL/min 、1.2 mL/min)。结果显示随机变动因素对精密度的影响较小，进一步确保了试验方法的科学性及数据的准确性，为对叶豆叶质量标准的进一步提高提供科学依据。