UHPLC-Q-TOF/MS分析美洲凌霄花与秋鼠曲草的化学成分△

李　融　韩海燕， 2　孙　群　张　健*

(1.苏州大学药学院，江苏　苏州　215123；　2.鹤壁市人民医院，河南　鹤壁　458000)

美洲凌霄花为紫葳科凌霄属植物美洲凌霄Campsis radicans (L.) Seem.的干燥花，性味甘、酸、寒，归肝、心包经，有凉血、化淤、祛风之功效，主治血滞经闭、痛经、崩中漏下、血热风痒等，江苏、上海、湖南等地有栽培[1]。中国有凌霄属2种植物，分别为凌霄 (Campsis grandiflora (Thunb.) K. Schum.) 和美洲凌霄 (Campsis radicans (L.) Seem.)[1]。2015版药典收录的中药凌霄花即为紫葳科植物凌霄或美洲凌霄的干燥花[2]。对凌霄花的化学成分及其药理活性研究较多[3]，但对于美洲凌霄花的化学成分研究较少。本课题组曾对美洲凌霄花进行了化学研究，分离得到鼠李柠檬素等[4]。秋鼠曲草Gnaphalium hypoleucum D. C.为菊科鼠曲草属植物，广泛分布于云南各地，也称鼠曲草、清明菜等，可作为野菜食用，民间医认为有止咳化痰、祛风除湿、解毒之功效，用于治疗伤风感冒，咳嗽多痰，风湿痛等[5]。该属植物中主要含有黄酮类和二萜类成分[6]。本课题组对秋鼠曲草进行了化学研究，分离得到5-羟基-3， 6， 7， 8-四甲氧基黄酮、木犀草素-4’-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-4’-O-β-D-葡糖糖苷等[7]。在此基础上，本课题组采用UHPLC-Q-TOF/MS法，对秋鼠曲草与美洲凌霄花进一步化学成分分析。

1　仪器与试药

1.1仪器ACQUITY UPLC/Q-TOF MS系统 (Waters公司，美国) ，采用电喷雾电离 (ESI)，二元高压泵，在线脱气装置，自动进样器，数据采集与处理采用MassHunter软件；UPLC C18分析柱 (2.1 mm×100 mm， 1.7 μm， ACQUITY UPLC BEH， Waters， USA)；数据采集与处理采用MassHunter 软件。

1.2试药美洲凌霄药材购自江苏省连云港，经苏州大学药学院陆叶老师鉴定为美洲凌霄Campsis radicans (L.) Seem.的干燥花。秋鼠曲草购自安徽亳州药材市场，经苏州大学药学院陆叶老师鉴定为秋鼠曲草Gnaphalium hypoleucum D. C.地上部分。自制铁冬青酸、蔷薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、科罗索酸、19α-羟基熊果酸、齐墩果酸、熊果酸、熊果醇为美洲凌霄的对照品，纯度为95%，自制芹菜素、木犀草素、5， 7-二羟基-3， 8， 4’-三甲氧基黄酮、luteolin-4’-O-β-D-glucoside为秋鼠曲草的对照品，纯度为95%，所有试剂均为色谱纯 (E. Merck， Darmstadt， Germany)，水为超纯水系统制备得到 (Millipore， Bedford， MA， USA)。

2　方法与结果

2.1对照品与样品溶液制备分别称取铁冬青酸、蔷薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、科罗索酸、19α-羟基熊果酸、齐墩果酸、熊果酸、熊果醇适量，加入甲醇配成1.00 mg·mL-1对照品溶液。分别称取芹菜素、木犀草素、5， 7-二羟基-3， 8， 4’-三甲氧基黄酮、luteolin-4’-O-β-D-glucoside，加入甲醇配成1.00 mg·mL-1对照品溶液。美洲凌霄花10g，100mL甲醇回流提取两次，回收溶剂得美洲凌霄花提取物，称取美洲凌霄花甲醇提取物适量，加入甲醇配成2.00 mg·mL-1样品溶液。秋鼠曲草20g，400mL90%乙醇回流提取2次，回收溶剂得秋鼠曲草提取物，称取秋鼠曲草乙醇提取物适量，加入甲醇配成2.00 mg·mL-1样品溶液。

2.2UHPLC-Q-TOF/MS条件美洲凌霄花化学分析的色谱条件：流动相A相为含有0.1%的甲酸的水，B相为含有0.1%甲酸的乙腈；流速为0.4 mL·min-1；梯度洗脱，0 ～ 10 min A:B (95:5 ～ 90:10)，10～25 min A:B (90:10 ～65:35)，25 ～32 min A:B (65:35 ～ 15:85)，32 ～ 35 min (15:85 ～ 0:100)；进样量为1μL；扫描波长为190～400 nm。

秋鼠曲草化学分析的色谱条件：流动相A相为含有0.1%的甲酸的水，B相为含有0.1%甲酸的乙腈；流速为0.4 mL·min-1；梯度洗脱，0 ～ 8 min A:B (95:5～75:25)，8 ～18 min A:B (75:25-25:75)，18～25 min A:B (25:75～0:100)，25～28 min (0:100)，28～31 min (0:100～95:5)；进样量为1μL；扫描波长为190～400 nm。

质谱条件：Agilent 6540 accurate mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies， USA) 系统，配有电喷雾离子源 (正离子模式) 和MassHunter 数据分析系统，雾化气温度为300 ℃，雾化气体积流量8.0 L·min，脱溶剂气 (N《》2)体积流量8.0 L·min-1， 毛细管电压为3500 V (正离子模式)，喷嘴电压为500 V，扫描范围 m/z 100～1700。

2.3UHPLC-Q-TOF/MS分析与平衡比较，对比所加对照品的基峰离子流图 (base peak chromatogram， BPC)，分析各个对照品的保留时间及主要质谱信号，并列出其分子离子峰(图1、2，表1)。参照对照品的保留时间及质谱信号，从美洲凌霄花甲醇提取物中鉴定出20个化合物，其中化合物3-O-β-D-glucopyranosylerythrodiol、3-hydroxyolean-12-en-28-O-β-D-glucopyranoside、6β-hydroxymaslinic acid、2 α， 3 α， 19 α， 23-tetraydroxy-urs-12-en-28-oic acid在凌霄属中未见报道(表1)。

参照对照品基峰离子流图的保留时间及质谱信号，从秋鼠曲草醇提取物中鉴定出19个化合物，主要为黄酮类化合物(图3、4，表2)。

表1　美洲凌霄花甲醇提取物的UHPLC-Q-TOF/MS分析

编号保留时间(min)化合物名称分子式[M+H]+/[M]+吸收波长113.12阿江榄仁树葡萄糖苷ⅡC36H58O10651.2818[M+H]+223213.48campsisideC25H30O11506.1803[M]+219,300315.59campneosideⅡC29H36O16640.2236[M]+200,220,290,330416.30ActeosideC29H36O15625.2117[M+H]+220,330516.66leucoscep-tosideAC30H38O15638.2875[M]+200,220,290,330617.28campneosideⅠC30H38O16654.2377[M]+220,320821.423-O-β-D-glu-copyranosyl-erythrodiolC36H60O7605.2609[M+H]+220921.763-hydroxyolean-12-en-28-O-β-D-glucopy-ranosideC36H60O7605.2406[M+H]+2201023.946β-hydroxy-maslinic acidC30H48O6504.3070[M]+2231124.452α,3α,19α,23-tetraydroxy-urs-12-en-28-oic acidC30H48O6504.2395[M]+2201224.62myrianthicacidC30H48O6504.2571[M]+2231327.73铁冬青酸C30H48O5489.3478[M+H]+2201427.85蔷薇酸C30H48O5489.3347[M+H]+2241527.94委陵菜酸C30H48O5489.3347[M+H]+2231628.26常春藤皂苷元C30H48O4473.3456[M+H]+2231729.16山楂酸C30H48O4473.3511[M+H]+2231829.22科罗索酸C30H48O4473.2861[M+H]+2241929.2819α-羟基熊果酸C30H48O4473.2812[M+H]+2232030.30齐墩果酸C30H48O3457.2923[M+H]+2222130.34熊果酸C30H48O3457.2939[M+H]+224

表2　秋鼠曲草醇提取物的UHPLC-Q-TOF/MS分析

3　讨论

通过对美洲凌霄花甲醇提取物进行的UHPLC-Q-TOF/MS分析，已解析得到的化合物中多数为三萜及其苷类成分，其中化合物13-21与对照品保留时间及质谱一致，分别鉴定为铁冬青酸、蔷薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、柯罗索酸、19α-羟基熊果酸、齐墩果酸、熊果酸；化合物1、8、9、10、11、12均为三萜及其皂苷类成分，化合物8、9、10、11在凌霄属植物中未见报道；化合物2、3、4、5、6在凌霄花中曾有报道，其中3、4、5、6为苯乙醇苷类成分，化合物2为环烯醚萜苷。由此推测美洲凌霄花中主要成分为三萜类、黄酮类、苯乙醇苷类及环烯醚萜类化合物，与凌霄花[3]中所报道的化合物结构类型基本一致。对秋鼠曲草醇提取物进行的UHPLC-Q-TOF/MS分析，已解析得到的化合物中多数为黄酮及其苷类成分，其中化合物10、13、15、16与对照品保留时间及质谱一致，分别鉴定为luteolin-4’-O-β-D-glucoside、木犀草素、芹菜素、5， 7-二羟基-3， 8， 4’-三甲氧基黄酮。