朝医传统方剂千金文武汤提取和精制工艺研究△

周　婷　刘　贺　郭建鹏

(1.长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室(延边大学)，吉林　延吉　133002；　2.浙江华海药业股份有限公司，浙江　临海　317000)

朝医传统方“千金文武汤”(《东医四象新编》元成庵)由葛根、黄芩、山药、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麦门冬等药味组成[1]，具有补肺敛肺，养胃生津，健脾固肾，利水消肿的功效。原方为水煎煮制备的汤剂，在剂型和生产工艺方面存在着一定局限性。

本文在不改变生产工艺性质的前提下，对“千金文武汤”提取和精制工艺进行研究，以药味中主要有效成分总多糖、总黄酮和总皂苷的提取量和保留率为指标，考察主要影响因素对提取量和保留率的影响，优选最佳工艺参数。

1　材料与仪器

1.1药材与试剂：方中葛根、山药、黄芩、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麦门冬等药材饮片由北京同仁堂(延吉)有限公司提供；ZTC1+1天然澄清剂(北京正天澄清剂技术有限公司，20150910)；其他试剂均为分析纯.

1.2主要仪器与设备：主要仪器有：提取浓缩机组(HZ-tqn-20L,上海辉展实验设备有限公司),紫外分光光度计(D-1900，日本日立公司)，电子天平(FA2004，上海良平仪器仪表有限公司)，循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城仪器厂)，旋转蒸发仪(R206，上海申生仪器厂)，电子调温电热套(98-1-B型，天津市泰斯特仪器有限公司)，恒温水浴锅 (金坛市恒丰仪器厂)。

2　方法与结果

2.1总黄酮含量测定方法学考察采取紫外分光光度法，测定复方提取液中总黄酮的含量[2]。

2.1.1溶液配制

2.1.1.1对照品溶液精密称量芦丁对照品适量，加入甲醇配至浓度为0.2 mg/mL。

2.1.1.2供试品溶液精密量取样品液1mL，用提取溶液稀释10倍，摇匀。

2.1.2检测波长的确定精密量取芦丁对照品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加入1mL 10%硝酸铝溶液，摇匀放置6min，继续加入10mL 5%氢氧化钠试液，摇匀，加水定容，混匀后放置15min，经紫外分光光度计扫描，确定检测波长定为510nm。

2.1.3线性关系考察线性回归方程为：Y=0.0008X+0.0029,r=0.9998。结果表明，在115～690μgmL-1范围内线性关系良好。

2.1.4精密度考察RSD值为0.281%，仪器精密度良好。

2.1.5稳定性考察RSD值为1.338%，供试品溶液稳定性良好。

2.1.6加样回收率考察平均回收率为99.56%，RSD值为0.74%，本实验方法具有较好的准确度及可行性。

2.2多糖含量测定方法学考察采取蒽酮-硫酸比色法[3]，测定复方提取液中总黄酮的含量。

2.2.1溶液配制

2.2.1.1蒽酮-硫酸溶液：量取蒽酮0.2g，加浓硫酸100mL，混匀。

2.2.1.2对照品溶液：精确称取葡萄糖对照品，置100mL容量瓶中,蒸馏水溶解稀释至刻度，精密吸取10mL置100mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀。

2.2.1.3供试品溶液：取样品液50mL，加入乙醇至醇含量在80%以上，不断搅拌至大量沉淀生成，静置12h，离心，收集沉淀，用蒸馏水溶解，滤过，滤液定容至100mL，摇匀。

2.2.2检测波长的确定量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mL葡萄糖对照品溶液，加水补足至1mL，摇匀，置于具塞试管中，加5mL蒽酮试剂，混匀,加塞密封，置于沸水浴中8min，取出冷却，静置10min。经紫外分光光度计扫描，确定检测波长为580nm。

2.2.3线性关系考察线性回归方程为：Y=0.0069X-0.0128，r=0.9998结果表明，在10.4～93.6μgmL-1范围内线性关系良好。

2.2.4精密度考察RSD值为0.061%，仪器精密度良好。

2.2.5稳定性考察RSD值为0.509%,在一定时间内稳定。

2.2.6加样回收率考察总多糖平均回收率为99.43%，RSD值为0.42%，本实验方法具有较好的准确度及可行性。

2.3皂苷含量测定方法学考察采用紫外分光光度法，测定萃取后皂苷类成分吸光度值[4]。

2.3.1溶液配制

2.3.1.1对照品溶液精密称取三七皂苷标准品5mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度。

2.3.1.2供试品溶液精密量取样品液10mL，置于分液漏斗中，加水至25mL，进行萃取。加入水饱和正丁醇溶，振摇萃取3次，每次20mL，分别取正丁醇层，合并。用氨试液洗涤3次，每次20mL，取正丁醇层蒸干，甲醇溶解其残渣，移至25mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

2.3.2检测波长的确定精密量取三七皂苷对照品溶液1mL，置10mL具塞试管中，蒸干溶剂，精密量取0.2mL5%香草醛-冰乙酸溶液，加入0.8mL高氯酸，混匀至残渣溶解，置60℃水浴中，加热10min后取出冷却，加5mL冰乙酸，摇匀。经紫外分光光度计扫描，确定检测波长为560n。

2.3.3线性关系考察线性回归方程为：Y=0.0039X-0.0298，r=0.9994。结果表明，19.2～96μgmL-1范围内线性关系良好。

2.3.4精密度考察RSD值为0.133%，仪器精密度良好。

2.3.5稳定性考察RSD值为1.066%，待测样品液在一定时间内稳定。

2.3.6加样回收率考察总皂苷平均回收率为100.13%，RSD值为0.67%，本实验方法具有较好的准确度及可行性。

2.4提取工艺研究

2.4.1提取方法取葛根10g、黄芩10g、山药10g、藁本10g、五味子5g、桔梗5g、升麻5g、白芷5g、麦门冬5g置圆底烧瓶中，浸泡1h，水煎煮提取2次，提取液浓缩定容至650mL。

2.4.2工艺参数优选以提取时间和溶剂用量为考察因素，总黄酮、总多糖和总皂苷提取量的综合评分为指标，采用正交设计试验优选工艺参数[5]。因素水平见表1。试验方案见表2。方差分析结果见表3。综合评分计算方法：综合分数 =(总黄酮含量/最大总黄酮含量)×40值+(总多糖含量值/最大总多糖含量)×30+(总皂苷含量值/最大总皂苷含量)×30。

方差分析结果表明，因素A对综合评分有显著性影响，B无显著性影响，进一步统计分析结果表明，B1 与B2无显著差异，B2> B3并具有显著差异，故确定的最佳提取方案为A1B2，即煎煮时间为120 min，90 min；溶剂用量为10，8倍。

表1　正交试验设计

表2　正交试验结果

表3　综合评分结果方差分析结果

2.4.3验证实验： 取同批次药材3份按最佳工艺进行提取，综合评分平均值为97，与正交设计试验结果最大值接近，表明优化后提取工艺稳定可行。

表4　最佳工艺综合评分

3　精制工艺研究

采用吸附澄清法对提取液精制[6]，选择ZTC1+1天然澄清剂，以精制液的澄明度为指标，考察澄清剂的用法用量，提取液浓缩程度、温度对精制效果的影响。

3.1澄清剂的配制A组分：取A组份适量，加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，加蒸馏水，静置24 h，配制成1%粘胶液。

B组分：取B组份适量，加入少量的1%醋酸溶液，搅拌成糊状，加入1%乙酸溶液，静置24 h，配制成1%粘胶液。

3.2吸附澄清剂的用法、用量对澄清工艺的影响分别考察吸附澄清剂4种不同用法对药液澄清效果的影响，结果见表4。

用法1：提取液浓缩至料液比为1:2，60℃，加入A组分，用量为药液的8%，边加边搅拌，静置24h，滤过。

用法2：提取液浓缩至料液比为1:2，60℃，加入B组分8%，用量为药液的8%，边加边搅拌，静置24h，滤过。

用法3：提取液浓缩至料液比为1:2，60℃，先加入A组分，用量为药液的8%，边加边搅拌，静置24h，滤过，加入B组分，用量为A组分的0.5倍，静置6h，滤过。

用法4：提取液浓缩至料液比为1:2，60℃，先加入B组分，用量为药液的8%，边加边搅拌，静置24h，滤过，加入A组分，用量为B组分的0.5倍，静置6h，滤过。

表5　吸附澄清剂的用法对药液澄明度的影响

注：+++严重浑浊 ++浑浊 +轻微浑浊-澄明

表5结果表明，吸附澄清剂的不同用法对澄明度影响显著，用法4的澄清效果最佳。在此基础上对澄清剂用量进行考察，结果见表6。结果表明，B组分用量为药液量的7%、8%时澄明度良好，故确定 B组分用量为7%。

表6　澄清剂B组分用量对药液澄明度的影响

3.3药液浓缩程度对澄清工艺的影响将提取液浓缩至不同程度，进行吸附澄清，结果见表7。结果表明，药液浓缩至料液比为1:1时澄清效果最佳。

表7　药液浓缩程度对药液澄明度的影响

3.4温度对澄清工艺的影响：将药液控制在不同温度，进行吸附澄清，结果见表8。结果表明，药液控制在60℃时澄清效果最佳。

表8　药液温度对药液澄明度的影响

3.5精制前后对比考察采用上述优选澄清工艺参数对提取液进行精制，测定精制前后提取液的浸膏得率、总黄酮、总多糖和总皂苷含量，结果见表9。结果表明，精制后提取液的浸膏得率显著下降，总黄酮、总多糖及总皂苷的保留率均在85%以上，表明采用该精制工艺可行。

表9　精制前后提取液的浸膏得率及有效成分含量

4　讨论

综合评分法可以同时兼顾多项指标对正交设计实验因素水平的影响，有利于全面评价结果，适合应用于中药提取工艺的优选实验中。

传统复方制剂成分复杂，采用吸附澄清法对提取液进行精制，浸膏得率降低，减少了使用剂量；同时主要成分保留率较高，临床疗效得到保障。

“千金文武汤”最佳提取工艺参数为水煎煮法提取2次，料液比1 : 10、2h，料液比1 : 8、1.5h；最佳精制工艺参数为：料液比为1 : 1，吸附澄清剂B组分用量为7%，吸附澄清剂A组分用量为3.5%，药液温度60℃。