电子腹腔镜清洗效果验证

郭小庆

（上海熠品质量技术服务有限公司，上海 201101）

临床使用后，可重复使用医疗器械必须经过严格且有效的再处理，以确保随后的安全使用。有三个类型的风险伴随医疗器械的再使用：1）疾病通过器械从一个病人向另一个病人传播；2）器械再处理后其性能不能满足临床使用要求；3）对血源性病原体或其他潜在性传染材料的职业暴露风险。再处理过程通常包括清洗、消毒或者灭菌，以及再处理后器械性能测试。根据医疗器械的预期用途、与人体接触的部位以及可能受到的临床污染类型、污染后使用所致感染的危险性大小及在患者使用之间的消毒或灭菌要求，国际上使用斯波尔丁分类规则，将可重复使用医疗器械分为高度危险性器械、中度危险性器械和低度危险性器械。

高度危险性器械：进入人体器官、无菌组织、脉管系统，或接触破损粘膜、破损皮肤的器械或有无菌体液从中流过的器械。每次使用后必须经全面清洗并灭菌处理。如腹腔镜，手术器械、血管内窥镜等

中度危险性器械：与完整粘膜接触，既不进入血液、人体器官、无菌组织也不接触破损粘膜、破损皮肤的器械。虽然完整粘膜能够耐受小数量的孢子，中度危险器械每次使用后要经过全面清洗和灭菌处理或高水平消毒处理。如肠胃镜、支气管镜、支气管镜等。

低度危险性器械： 不与粘膜接触，而与完整皮肤接触的器械。这类器械应当进行全面清洗、并经过中等水平或低水平消毒处理，或是只进行全面清洗处理。如听诊器、心电电极等。

清洗是第一个也是关键的再处理步骤。临床使用后器械外部或内部附着的临床污染物（如：微生物、有机物质、无机物质等）去除不彻底，会对随后的消毒或灭菌效果产生不利影响，甚至导致对传染性病原体消毒或灭菌不彻底，造成交叉感染等医疗事故。清洗方法通常包含手洗（擦拭、冲洗、刷洗等）和机洗。作为微创手术中常用的腹腔镜，由于其特殊的结构，临床上通常通过手洗的方式进行全面清洗。本文通过模拟使用试验，依照制造商说明书的清洗方法，验证光学硬镜和电子镜的手动清洗方法的有效性，适合随后的灭菌过程。

1 材料与方法

1.1 样品信息

1.1.1 结构和组成

1.1.2 临床应用污染和清洗的特殊结构

图1 电子腹腔镜结构示意图

保护窗片和插入部分前端、插入部分前端和插入部分后端、插入部分后端和手柄、手柄结构件之间、按键与手柄、手柄与传输线缆之间。

1.1.3 预期用途和临床应用污物

电子腹腔镜与其摄像系统共同组成电子腹腔镜系统。电子腹腔镜系统主要适用于腹部外科手术的辅助治疗，为手术过程提供手术部位实时的清晰图像，接触人体内无菌组织的医疗器械。

临床应用污染主要有血液、组织碎屑、细菌残留。

器械直接污染部位有：保护窗片、镜管；间接污染部位有手柄。

1.2 试验用主要试剂和仪器

1.2.1 主要仪器

生化培养箱（上海申骋仪器科技有限公司），高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司），可见分光光度计（上海奇立科学仪器有限公司），超净工作台（苏州沈氏净化设备有限公司），生物安全柜（阿尔泰实验室设备有限公司）。

1.2.2 主要试剂

大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）（Lot：20151201001，杭州百思生物技术有限公司），氯化钠（NaCl）（Lot：10019318，国药集团化学试剂有限公司），氰化高铁血红蛋白标准液（Lot：20170826，天津市现代高科技研究院中山研究所），总蛋白定量检测试剂盒（BCA法）（Lot：20170615，南京建成生物工程研究所），胎牛血清（Lot：20161214，杭州四季青），脱纤维绵羊血（无菌）（Lot：20170707，Solarbio），RPMI培养基（Lot：AB10113944，Hyclone），D-无水葡萄糖（Lot：C10093638，麦克林），快速高效多酶清洗液（Lot：1612ST2，3M公司）。

1.3 试验过程

1.3.1 人工污物（ATS）、目标微生物和清洗剂

人工污染物（ATS）

电子腹腔镜所受的临床使用污染类似，为模拟其所受的污染，实验室配制含有牛血清、无菌羊全血、RPMI 1640培养基、碳水化合物（葡萄糖）、无菌蒸馏水和黄原胶。RPMI 1640培养基作为基础介质，模拟人体生理体液成分；无菌养全血用于模拟血液污染成分；牛血清用于模拟有机蛋白成分；葡萄糖用于模拟碳水化合物成分；无菌蒸馏水用于稀释人工污物；黄原胶用于调整人工污物的粘稠度。

目标微生物

为模拟临床污染中的微生物，采用萎缩芽孢杆菌悬液（ATCC 9372）作为目标微生物，菌落浓度108 CFU/mL。

清洗剂

使用中性低泡多酶清洗剂，含有脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。（3 M安必洁）。

1.3.2 试验方法确认

试验方法通过设置阴性组和阳性组做对照，先要进行方法确认。

测试器械及对照器械（试剂）：

组别 制备方法测试器械 接种已知数量的接种液、进行清洗、进行萃取的器械阴性对照器械 不接种接种液、进行清洗、进行萃取的器械阳性对照器械 接种已知数量的接种液、不进行清洗、直接进行萃取的器械阴性对照试剂 空白对照，即不含器械的萃取液阳性对照试剂 将已知数量的接种液直接接种添加到空白萃取液中所得到的溶液

注1：使用相同的方法和条件对测试器械和阳性对照器械进行接种。

注2：阴性对照器械的污物残留应等于或稍大于阴性对照试剂。

注3：阳性对照器械的污物残留应等于或稍小于已知的接种液量。

注4：试验使用3个重复测试器械、2个重复阳性对照器械。

分别对阳性对照器械萃取液、阴性对照器械萃取液、阳性对照试剂和阴性对照试剂和进行检测，来确认蛋白质、血红蛋白、碳水化合物、目标微生物的含量。

预处理

在试验开始前，所有的样品按照说明书的方法，进行全面清洗处理。

器械接种

取适量的人工污物和目标微生物悬液，进行混合配置接种液。接种液含有至少108 CFU/mL目标微生物。

将接种液预热至37度后，取完整的试验样品，将样品倒置在无菌器皿中，取适量接种液用微量滴定管从保护窗端滴注腹腔镜，直至接种液接触到手柄。这样确保在临床使用时腹腔镜可能被污染的部位都被接种。

接种结束后，腹腔镜在室温下干燥30分钟，模拟腹腔镜临床使用后到清洗处理的等待时间。

注1：测试器械和阳性对照器械采用相同的接种方法。

注2：阳性对照器械接种结束，干燥30分钟后，直接浸提后进行检测。

清洗

试验采取手工清洗的方式。清洗使用合适的清洗剂、冲洗水和工具。为模拟医疗机构人员真实清洗过程以及考虑在清洗操作时可能发生的使用错误（清洗人员依照制造商提供的说明书进行清洗活动的人因工程因素），实验人员先认真阅读器械使用说明书并依照其使用说明书要求进行清洗操作，穿戴必要的个人防护用品如手套、口罩等。

清洗试验过程采用在制造商规定的最不利条件下进行，如最低温度、最短时间、最低浓度等。试验清洗过程和制造商规定的过程如下表，测试器械和阴性对照器械采用相同的试验清洗的条件。

表1 电子腹腔镜清洗过程

1.3.3 浸提检测

1.3.3.1浸提

采用棉球擦拭的方式对腹腔镜进行全面浸提，将棉球剪碎后和洗脱液斡旋震荡5×1 min，离心，取上清液，一部分用于理化残留量（蛋白质、血红蛋白和碳水化合物）的测试，一部分用于生物负载检测。

1.3.3.2蛋白质

用BCA定量检测试剂盒检测总蛋白质浓度。按照试剂盒说明书，首选将工作液与双蒸水、标准样本或工作液混合，涡旋混匀，37℃孵育30 min，再按要求加一定体积的终止液，涡旋混匀，在室温下静置5 min。最后用双蒸水在波长562 nm处调零，测试并读出各管吸光度值。

计算公式：

1.3.3.3血红蛋白

用氰化高铁血红蛋白试剂测定血红蛋白浓度。在1～50 μg/mL范围内稀释6个梯度，所用稀释试剂为空白，在540 nm波长处，用分光光度计建立标准曲线，血红蛋白浓度为横坐标，A540为纵坐标。

取1.5 mL的氰化高铁血红蛋白溶液与1.5 mL的样品溶液混合，静置5 min，在540 nm波长条件下读取吸光度。根据标准曲线计算测试样品中血红蛋白的浓度。

1.3.3.4碳水化合物

用苯酚-硫酸法测定碳水化合物的含量。取1 mL合适浓度的葡萄糖，添加4 mL 10%苯酚溶液和4 mL蒸馏水，随后快速添加20 mL浓H2SO4，再室温放置10 min，在650 nm 350 nm的波长范围内测定混合物的最大吸光度（空白调零溶液为：1 mL蒸馏水+1 mL 10%苯酚溶液+5 mL浓硫酸）。根据葡萄糖浓度和其测试的吸光度建立标准曲线。

同样的方法测定样品吸光度，再根据标准曲线计算碳水化合物的浓度。

1.3.3.5生物负载

测试器械和阴性对照器械浸提液采用梯度稀释法稀释至10-1，10-2和10-3，阳性对照器械浸提液采用梯度稀释法依次稀释至10-6，10-7和10-8，各取1 mL洗脱液用平板倾注法加入制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基，胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基平板中。取1 mL阴性对照试剂用平板倾注法加入培养基平板中，阳性对照试剂采用梯度稀释法稀释至10-6，10-7和10-8，取1 mL用平板倾注法加入培养基中，胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基于（30-35）℃下培养5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基于（20-25）℃下培养7天。

1.3.4 清洗效果可接受指标

清洗效果可接受指标见表2。

表2 清洗效果可接受指标（n）

2 结 果

表3 清洗后理化指标残留量（n）

表4 清洗后目标微生物含量（n）

3 结 论

内窥镜作为临床微创手术中常用的器械，其重复处理的有效性直接影响临床使用的安全性。器械清洗作为再处理的第一和关键步骤，清洗效果直接影响随后的消毒或灭菌过程，制造商应向使用者提供经确认的有效清洗方法。

本试验通过模拟使用的方法，对两种不同类型的内窥镜施加模拟临床使用污染物，在最不利的条件下，进行清洗。清洗之后光学硬镜和电子腹腔镜样品，蛋白质、血红蛋白、碳水化合物的含量，以及微生物的减少量均为可接受的水平，说明测试样品的清洗方法有效。