高效液相色谱法同时测定抗骨增生丸中柚皮苷和淫羊藿苷的含量

罗亚玲，李　冰，吴　强

(1.四川省食品药品检验检测院，四川 成都　611731；2.乐山市中医医院，四川 乐山　614000)

0　引　言

1　材料与仪器

1.1　材　料

实验所用材料包括：抗骨增生丸(大蜜丸，每丸重3 g，批号，20150402)，由吉林龙泰制药股份有限公司生产；淫羊藿对照品(批号，110737-201516，含量94.2%)，柚皮苷对照品(批号，110722-201613，含量94.3%)，均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯.

1.2　仪　器

实验所用仪器包括：Agilent 1200型高效液相色谱仪(安捷伦公司)，LC-20A型高效液相色谱仪(岛津公司)；CPA-225型电子天平(赛多利斯公司).

2　方法与结果

2.1　色谱条件

实验的色谱条件为：色谱柱为Thermo Syncronis C18(250×4.6 mm，5 μm)；波长参考《药典》各药材项下含量测定波长，将淫羊藿苷的检测波长定为270 nm，柚皮苷的检测波长定为282 nm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，并按表1进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min；理论板数分别按柚皮苷峰和淫羊藿苷峰计算，均应不低于5 000.

表1　梯度洗脱程序表

2.2　对照品溶液的制备

分别精密称取柚皮苷对照品12.53 mg、淫羊藿苷对照品11.41 mg，置50 mL量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为柚皮苷贮备溶液与淫羊藿苷贮备溶液.精密吸取柚皮苷贮备溶液1 mL与淫羊藿苷贮备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得每1 mL含柚皮苷0.02363 mg与淫羊藿苷0.02150 mg的混合对照品溶液.

2.3　供试品溶液制备

取抗骨增生丸(大蜜丸)，研碎，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定质量，90 ℃加热回流45 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液.

2.4　专属性实验

取抗骨增生丸以及缺骨碎补的阴性对照样品和缺淫羊藿的阴性对照样品按“2.3”项方法制备供试品溶液及阴性供试品溶液并进样分析.结果显示：阴性供试品在柚皮苷峰与淫羊藿苷峰位置处无相应的峰出现(见图1)，表明阴性无干扰，专属性强.

2.5　精密度实验

取同一对照品溶液5 μL，重复进样6次，计算得柚皮苷和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.07%和0.16%(n=6).结果表明，2种对照品溶液的RSD均小于1.0%，表明仪器的精密度良好.

2.6　稳定性实验

精密称定供试品溶液5 μL在0、2、6、12、24 h时进样测定，计算得柚皮苷和淫羊藿甘峰面积的RSD分别为0.21%和0.23%(n=5)，均小于1.0%.结果表明,供试品溶液在24 h内稳定性良好.

2.7　重复性实验

取抗骨增生丸样品6份，分别制备供试品溶液并进样测定，计算柚皮苷和淫羊藿苷的含量分别为0.5573 mg/g和0.5219 mg/g，RSD分别为0.39%和1.6%(n=6).样品重复测定6次结果的RSD小于2.0%,表明本方法的重复性良好.

2.8　线性范围考察

按照“2.2”项对照品溶液的制备的方法，将柚皮苷与淫羊藿苷对照品溶液精密稀释成系列浓度，注入液相色谱仪测定.以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归.测定结果见表2、3与图2、3.

表2　柚皮苷线性范围测定结果

表3　淫羊藿苷线性范围测定结果

结果表明：柚皮苷的线性方程为，Y=1696X-117.6(r=1.0000,n=6)，进样量在2.9539～236.3158 ng的范围内线性关系良好；淫羊藿苷的线性方程为:Y=2065X+458.3(r=1，n=6)，进样量在2.6871～214.9644 ng范围内线性关系良好.

(a)抗骨增生丸样品液相色谱图

(b)柚皮苷对照品液相色谱图

(c)缺骨碎补阴性样品液相色谱图

(d)淫羊藿苷对照品液相色谱图

(e)缺淫羊藿阴性样品液相色谱图

图1样品液相色谱图

图2柚皮苷标准曲线

图3淫羊藿苷标准曲线

2.9　回收率

取6个具塞锥形瓶，分别精密加入柚皮苷与淫羊藿苷对照品贮备溶液(柚皮苷浓度为0.2363 mg/mL、淫羊藿苷浓度为0.2150 mg/mL)各1 mL，蒸干溶液；取6份已知含量的抗骨增生丸样品(批号，101，柚皮苷含量为0.5573 mg/g、淫羊藿苷含量为0.5219 mg/g)约0.5 g，精密称定，置上述锥形瓶中，分别制备供试品溶液并进样测定，计算回收率，结果见表4、表5.

表4　柚皮苷加样回收实验结果

表5　淫羊藿苷加样回收实验结果

实验结果表明：柚皮苷与淫羊藿苷加样回收率分别为96.90%和99.71%，其RSD分别为1.52%和1.80%.结果表明，本方法回收率良好.

2.10　耐用性考察

取抗骨增生丸样品进行耐用性考察，实验采用不同色谱柱为：Welch Ultimate C18(250×4.6mm，5 μm)，Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)，Thermo Syncronis C18(250×4.6 mm，5 μm).实验结果显示，待测色谱峰与杂质峰均能分开(见表6).

表6　耐用性考察结果

耐用性考察结果表明：RSD均小于1.0%，表明本方法耐用性良好.

3　结　语

本研究采用《中国药典》2015版抗骨增生丸淫羊藿含量测定项下的色谱条件，样品中柚皮苷色谱峰与其他组分色谱峰不能较好分离.经过进一步对比研究,最终选择乙腈—水为流动相进行梯度洗脱，采用该流动相配比简单，出峰时间短，峰形好，理论塔板数高，分离效果好.另外，本研究分别考察了50%甲醇和80%甲醇作为提取溶剂，采用超声提取和加热回流2种提取方式，提取30、45、60 min，2种成分均以50%甲醇回流45 min提取的效率较高.同时，采用本研究确定的方法，并参照抗骨增生丸处方及服用量，以平均含量的70%折算，暂定含量限度为：本品含骨碎补以柚皮苷计，水蜜丸每1 g不得少于0.08 mg/g；小蜜丸每1 g不得少于0.06 mg/g；大蜜丸每丸不得少于0.18 mg/丸.实验结果表明，本方法简便，稳定、重复性好，能准确地对抗骨增生丸中柚皮苷和淫羊藿苷同时进行测定，可为抗骨增生丸质量标准进一步完善提供参考.